肺腺癌中MFG-E8的表達及其臨床意義

姚華寧，延 文，賈 珉，陳 超

肺癌是最常見的惡性腫瘤，5年生存率僅為10%～15%[1-3]。肺腺癌具有高度侵襲性，病死率高，預后差，缺乏有效的預后標志物[4]。因此，探究新的生物學標志物對肺腺癌的治療及預后意義重大。乳脂球表皮生長因子-8(milk fat globule epidermal growth factor-8, MFG-E8)是一種由巨噬細胞分泌的糖蛋白。MFG-E8已被證實是清除凋亡細胞的重要因子，也是免疫系統中的重要因子[5-7]。近年，有研究表明MFG-E8在多種疾病中發揮特殊作用。目前，MFG-E8在肺腺癌中的作用尚不清楚。本實驗采用免疫組化法檢測MFG-E8蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達和定位，分析MFG-E8表達與肺腺癌臨床病理特征和預后的關系，為肺腺癌的診斷與治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料90例肺腺癌標本來自上海芯超生物科技公司組織標本庫。其中88例肺腺癌患者獲得隨訪，時間1～121個月，68例因癌癥相關死亡；5年生存率為75.6%。2例失訪，隨訪率為97.8%。

1.2 方法收集腫瘤及癌旁正常肺組織的手術切除標本，與上海國家生物芯片工程中心聯合制作組織微陣列(TMA)切片，4 μm厚切片，采用免疫組化EnVision兩步法染色。一抗MFG-E8(稀釋比1 ∶50)購自Santa Cruz公司。二抗購自Dako公司。以PBS代替一抗作為陰性對照。具體染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 結果判斷由兩位高年資病理醫師采用雙盲法獨立評估組織芯片免疫組化染色結果。MFG-E8的判讀標準：每張切片均在高倍鏡下(400×)隨機選取10個視野，讀取平均細胞數。(1)按腫瘤陽性細胞百分比進行評分：陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按陽性細胞染色強度進行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將上述兩項評分結果相乘：0～4分為陰性，5～12分為陽性[8]。

1.4 統計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料的組間比較采用χ2檢驗，數據間相關性分析采用Spearman相關分析，生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法。

2 結果

2.1 肺腺癌及癌旁組織中MFG-E8的表達MFG-E8表達定位于細胞質及細胞膜(圖1)。MFG-E8在癌旁組織和肺腺癌組織中的陽性率分別為14.44%(13/90)、94.44%(85/90)。MFG-E8在肺腺癌中的表達明顯高于癌旁正常肺組織(P<0.001)。

圖1 MFG-E8的表達：A.MFG-E8在肺腺癌癌旁組織中呈陰性；B.MFG-E8在肺腺癌組織中呈弱陽性；C.MFG-E8在肺腺癌組織中呈強陽性，EnVision兩步法

2.2 MFG-E8表達與肺腺癌臨床病理特征的關系統計分析顯示，MFG-E8表達與患者性別、年齡、有無淋巴結轉移、TNM分期無關，與腫瘤大小呈正相關(P<0.05，表1)。

表1 MFG-E8表達與肺腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 MFG-E8表達與肺腺癌患者預后的關系將90例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織的MFG-E8表達進行對比分析，結果顯示：MFG-E8高表達組肺腺癌患者的生存率明顯低于低表達組患者(P<0.001)。MFG-E8表達與肺腺癌患者生存率呈負相關(圖2)。

圖2 MFG-E8表達與肺腺癌患者預后的關系

3 討論

MFG-E8又稱乳凝集素，通過橋接凋亡細胞和吞噬細胞，促進吞噬細胞對凋亡細胞的吞噬，在介導穩態維持、免疫耐受和增強血管生成中發揮重要作用[9-10]。MFG-E8由2個重復的表皮生長因子樣結構域(EGF樣結構域)、2個重復的盤素樣結構域(C結構域)和1個蛋白樣結構域組成。在EGF樣結構域，有一個整合素結合基序(integrin-binding motif)，促進αvβ3和αvβ5整合素異二聚體的細胞黏附，并導致整合素介導的信號轉導[10]。研究表明，該蛋白具有多種功能。在腫瘤微環境中MFG-E8通過協調αvβ3信號通路，促進黑色素瘤進展[11]。MFG-E8在結直腸癌[12]、口腔鱗狀細胞癌[13]、肝細胞癌[14]、乳腺癌[15-16]中的表達明顯上調。MFG-E8基因缺失可預防小鼠缺氧引起的肺動脈高壓[17]，但是MFG-E8在肺腺癌中的作用和機制尚不清楚。

此前有研究報道，MFG-E8促進口腔鱗狀細胞癌的腫瘤進展[13]。Jia等[12]也證實MFG-E8在人類結直腸癌中表達的高水平調控。本實驗發現，在肺腺癌組織中MFG-E8蛋白表達水平明顯高于癌旁正常肺組織，提示MFG-E8高表達可能促進正常肺泡上皮細胞向肺腺癌的惡性轉化，在此過程中發揮癌基因作用。其機制可能為癌癥干細胞能特異性刺激腫瘤相關巨噬細胞表達MFG-E8，MFG-E8通過STAT3和Hedgehog信號通路誘導癌癥干細胞向腫瘤轉化以及對抗腫瘤藥物的抵抗。本實驗亦發現MFG-E8高表達與腫瘤大小明顯相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、有無淋巴結轉移及TNM分期無關，提示MFG-E8促使腫瘤進展。MFG-E8是血管內皮生長因子誘導的血管生成的關鍵，其表達上調也可以促進腫瘤血管的生長[9-10]，從而促成腫瘤進展。有報道稱MFG-E8蛋白高表達是黑色素瘤[11]的獨立不良預后因素。然而，MFG-E8在肺腺癌中的表達及與患者預后的關系至今尚未見文獻報道。本實驗結果顯示，肺腺癌組織中MFG-E8的表達明顯高于癌旁組織，MFG-E8高表達組肺腺癌患者的生存率明顯低于低表達組患者(P<0.001)，提示MFG-E8可能是肺腺癌的不良預后潛在標志物。

本實驗發現MFG-E8在肺腺癌組織中高表達，其表達與腫瘤大小和不良預后相關，提示MFG-E8可能促進肺腺癌的發生，是一種新的肺腺癌預后標志物。