一種快捷精準的組織芯片制作方法

徐龍寬，鐘新梅，王文麗，伍愛華，韋 輝，李運千，莫長順，周英瓊，王緒明

組織芯片是將大量生物組織樣本按預先設計的陣列圖排列在同一蠟塊上形成矩陣的微縮組織塊[1]。組織芯片技術的建立實現了在一次實驗中對大量樣本進行平行研究，減少實驗誤差的同時，節省了試劑和時間，隨著該項技術的不斷發展，被廣泛運用到免疫組化、原位雜交和熒光原位雜交等實驗中。目前市場上的組織芯片成品價格昂貴，已有文獻介紹組織芯片技術的制作及應用，但存在制作過程較復雜和位點較少等不足[2-10]。本文現介紹一種操作簡單、經濟實用的組織芯片制作技術，通過電腦設計微陣列網格紙，用包埋機制作空白受體蠟塊，成型后用電磨筆打孔，最后用手持組織芯片槍獲取供體組織芯片柱，制作組織芯片。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年8月桂林醫學院附屬醫院病理科經病理檢查的正常扁桃體、胎盤和肝臟組織，包埋成供體蠟塊。

1.2 主要耗材及儀器優質包埋石蠟(熔點57～60 ℃，廣州維格斯公司)，手動組織芯片取樣槍(型號1026，廣州潔利公司)，手持微型電磨筆(琨匠voltage，3.7v，上海欽同公司)，組織包埋機(Thermo Histostor)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9070A，上海精宏公司)，高速黑白激光打印機(brotherHL-2140)，切片機(Leica RM2235)，常規不銹鋼包埋底模(規格：37 mm×24 mm×9 mm，江蘇世泰公司)，黏附載玻片(海門曙光器材廠)，普通A4紙。

1.3 方法

1.3.1制作工具 電磨筆配套直徑1.0、1.5、2.0 mm的麻花鉆頭，用于受體蠟塊的打孔(圖1)，手動組織芯片取樣槍配套直徑1.0、1.5、2.0 mm的槍頭，用于供體蠟塊的取樣及組織芯在受體蠟塊的植入(圖1)。

圖1 制作工具：A.手持微型電磨筆；B.電磨筆對應麻花鉆頭；C.取樣槍配套對應的槍頭；D.手動組織芯片取樣槍 圖2 自制7×11位點、8×13位點和10×16位點正方格網格紙及日常使用的不銹鋼底模 圖3 打孔前(上圖)及打孔后(下圖)的蠟模 圖4 8×13位點組織芯片HE染色低倍鏡(左圖)和高倍鏡(右圖)圖片 圖5 8×13位點組織芯片Hep Par-1蛋白免疫組化染色低倍鏡(左)和高倍鏡(右)圖片 圖6 8×13位點組織芯片Ki-67蛋白免疫組化染色低倍鏡(左)和高倍鏡(右)圖片

1.3.2受體蠟塊的制作 (1)在Microsoft Word 2007中插入表格，選擇表格屬性，在表格-選項-默認單元格邊距中將上下左右均設置為0；行指定高度選擇固定值，列指定寬度，行和列的數值均比芯片孔徑大1 mm，如1.0 mm孔徑組織芯片，表格的行和列均設為2 mm；A4紙打印正方格網格紙，裁好后備用。采用上述方法可設計160(10×16)位點、104(8×13)位點及77(7×11)位點3種不同規格大小的微陣列，分別應用于1.0、1.5、2.0 mm的組織。(2)裁剪好的網格紙置于包埋底模底部包埋成型后備用(圖2)。(3)用電磨筆配套相應孔徑的麻花鉆頭垂直于受體蠟塊對應網格打孔。(4)去掉網格紙，用切片機按10 μm厚度粗修受體蠟塊至平整(圖3)。

1.3.3供體蠟塊的處理 (1)用切片機粗修(5 μm)供體組織蠟塊，暴露組織至需要區域。(2)粗修后組織蠟塊置于37 ℃烘箱中預熱30 min軟化[4]，避免打孔時因組織過硬出現裂痕。

1.3.4組織芯片的制作 (1)使用組織芯片取樣槍在處理好的供體蠟塊上取出需要的組織芯柱。(2)將組織芯柱植入對應受體蠟塊孔位。(3)全部移入后用玻璃板壓平，盡量使組織在同一平面。(4)將組織芯片蠟塊放入底模，使包埋盒在上，組織芯在下，保證組織芯柱落在同一平面上，平整放入預熱到57 ℃的烘箱中加熱30 min，使組織芯與受體蠟塊融為一體。(5)關閉烘箱，打開烘箱門自然冷卻10 min后取出組織芯片蠟塊，置于包埋機冷凍臺冷卻10 min。(6)冷卻后迅速敲出組織芯片。(7)切片機上稍粗修(5 μm)至最大切面，組織芯片蠟塊即制作完成。

1.3.5切片 組織芯片蠟塊置于4 ℃冰箱中充分預冷4 h后用切片機切取白片[5]。將切片放入46 ℃溫水中充分展片，用黏附載玻片撈取切片，自然晾干后65 ℃烤片2 h待用。

1.3.6HE染色 組織芯片進行常規HE染色，顯微鏡下評估組織芯片的HE染色效果。

1.3.7免疫組化 組織芯片以Hep Par-1、Ki-67抗體染色，染色方法為羅氏Ventana全自動免疫組化染色步驟。

2 結果

2.1 組織芯片成功制備組織芯片蠟塊，組織芯柱與受體蠟塊結合緊密，位點排列整齊，無移位、變形、缺失，未見開裂及氣泡產生。

2.2 HE染色結果以104(8×13)位點為例，制作的組織芯片染色結果顯示，各位點組織形態結構及細胞結構均清晰可辨(圖4)。

2.3 免疫表型以104(8×13)位點為例，組織芯片Hep Par-1(圖5)及Ki-67(圖6)免疫組化染色結果顯示，Hep Par-1蛋白表達定位于肝細胞胞質，Ki-67蛋白表達定位于細胞核，其蛋白定位分布、染色強度及特異性與常規石蠟切片行免疫組化染色相符。

3 討論

組織芯片因其規模大、高通量、標準化等優點，具備十分重要的科研價值，目前最為標準的制作方法為運用全自動組織芯片儀制作，但設備昂貴，成本較高導致難以普及，而手工制作方法種類較多，主要有需要受體蠟塊[3-5,7-9]和澆注式[2,6,10]兩大類。澆注式對操作者的操作水平要求較高，且芯片陣列易出現錯亂現象；而需要受體蠟塊的方法可通過購買商品化的受體蠟塊[4,7]或手工自制[3-5,8-9]，商品化受體蠟塊成本較高，需要二次增加固相支撐(包埋盒)的步驟，過程繁瑣且溫度較難掌控，常因受體蠟塊和組織芯柱融合不佳導致切片時出現開裂；手工自制的規格不統一，位點排列不規范，制作過程較繁瑣。本方法的優點：(1)電腦設計排列位點靈活標準；(2)微陣列網格紙直接黏附于受體蠟塊，打孔位點排列整齊；(3)受體蠟塊和固相支撐一次成型，黏附牢固；(4)鉆頭和組織槍孔徑標準化且有不同規格可選擇；(5)成本較低；(6)實驗重復性好，操作簡單；(7)切片染色質量較好，位點變形率、丟失率低。

為提高芯片制作的效率及質量，總結幾點經驗：(1)網格紙在包埋時要盡量貼近底部鋪平，防止包埋時因網格紙不平整導致受體蠟塊底部凹凸不平；(2)打孔時盡量垂直于網格紙，使各位點保持大小一致；(3)打孔后務必粗修受體蠟塊使各位點在同一平面，避免后期切片時位點缺失；(4)選擇供體蠟塊時盡量避免較薄的組織，以免引起位點缺失；(5)芯片柱和受體蠟塊融合時溫度過高、時間過長，石蠟完全液化易引起點陣亂序，而溫度過低時間過短則融合不充分影響切片，所以建議融合溫度為石蠟熔點的下限，即57 ℃，時間在30 min以內，可以反復融合2～3次以達到理想狀態；(6)切片時先將蠟塊切至最大切面，4 ℃預冷30～60 min后直接切片避免再修片，可提高切片質量。

本方法采用電腦軟件設計組織微陣列及電磨筆打孔，確保各點陣排列整齊，HE及免疫組化染色效果良好，取得滿意的效果，無論在制作技術還是制作成本上均具有明顯的優勢，可在臨床工作及科學研究中廣泛開展。