當歸揮發油的提取工藝優化及抗氧化性研究

郭田甜，房兆營，劉震遠，張微，畢艷艷，孫艷，關永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南貝特制藥有限公司，山東 臨沂 276006)

當歸屬于傘形科植物，入肝、心、脾經，有補血活血、潤腸通便等功效[1]。當歸化學成分主要含有揮發油、有機酸類、多糖類、黃酮類等多種物質，而揮發油是當歸主要功效成分之一，含量約為1%[2-3]。揮發油大多由小分子物質組成，容易被機體快速吸收，大部分揮發油類具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌驅蟲及鎮痛等方面的藥理作用[4-5]。當前包含揮發油的中藥材廣泛，尤以傘形科[6]、唇形科[7]、菊科[8]、姜科[9]、蕓香科[10]等科含量較為豐富。近年來，含揮發油類的中藥材在保健、醫療、日用產品等方面的研究日益增多，展現出廣闊的應用前景。

揮發油提取方法一般分為有機溶劑萃取法[11]、超臨界萃取法[12]與水蒸氣蒸餾法[13]等，前兩種提取方法具有操作繁瑣、成本高、環境污染嚴重等缺點，而水蒸氣蒸餾法克服了以上問題，成為了提取方法研究熱點。齊巧明等[14]用水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發油并優化了提取工藝，結果表明該法揮發油提取率高，操作方法可行，工藝參數穩定。除此之外，大部分揮發油都具有抗氧化的藥理作用，當機體內自由基含量過高時，對機體內的核酸、蛋白質等產生破壞，加速機體代謝、衰老，而揮發油能夠有效清除體內自由基類物質，有益于維持身體健康[15]。目前，當歸藥材的研究主要集中在栽培種植和藥理作用方面，但對當歸揮發油的抗氧化性報道相對較少，所以此方面的研究與應用非常必要。

本文以水蒸氣蒸餾法提取當歸揮發油，以當歸粒徑、加水倍數、提取時間作為考察因素。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對提取工藝進行了優化，篩選出最佳工藝條件參數，并對所提取的揮發油進行了抗氧化研究，為日后當歸揮發油大規模提取生產及中藥材資源的綜合開發利用提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

當歸藥材來源于魯南厚普制藥有限公司，經魯南厚普制藥有限公司質檢中心高級工程師范建偉鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典(一部)》[16]來源規定；無水乙醇(分析純)，天津天力化學試劑有限公司；抗壞血酸(純度99%)，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)，重慶茂業化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，美國Sigma-Aldrich生物技術公司。

1.2 試驗儀器

S-10揮發油提取器，天津歐普化學儀器有限公司； MS1003TS02型電子天平，梅特勒-托利多有限公司；KM-1型可調控溫電熱套，鄄城華魯電熱儀器有限公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，北京賽默飛科技有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司；SPECORD 210 PLUS紫外分光光度計，江蘇精誠儀器設備有限公司。

1.3 當歸揮發油提取工藝優化

1.3.1 當歸揮發油提取工藝

使用水蒸氣蒸餾法，取當歸粉碎后過篩，將400 g當歸顆粒置于圓底燒瓶中，加自來水3～7倍加熱回流，提取4～8 h后停止蒸餾，將藥液靜置冷卻，待油水分離后收集揮發油。

1.3.2 單因素試驗設計

經預試驗確定將當歸粒徑、加水倍數、提取時間3個因素作為當歸揮發油提取工藝的考察對象，結果表明當歸粒徑可取值范圍為10～80 目，加水倍數可取值范圍為當歸質量的3～7倍，煎煮時間可取值范圍為4～8 h，由此設計單因素試驗：各組平行均稱取400 g陰干后的當歸，固定加水倍數5倍，煎煮時間6 h，分別考察10、24、50、65、80 目篩粉碎粒徑對揮發油提取率的影響；固定當歸粒徑50 目，煎煮時間6 h，分別考察3、4、5、6、7倍加水量對揮發油提取率的影響；固定當歸粒徑50 目，加水倍數5倍，分別考察4、5、6、7、8 h煎煮時間對揮發油提取率的影響。

按2020年版《中國藥典(四部)》[17]中揮發油測定甲法測定當歸揮發油提取率，具體計算方法見式(1)。

(1)

式中，V為當歸揮發油出油量，mL；M為當歸藥材顆粒質量，g。

1.3.3 響應面優化試驗設計

根據響應面試驗設計原理和單因素試驗結果以及生產實際需要，選取當歸粒徑(A)、加水倍數(B)、提取時間(C)等3個影響因素，以揮發油提取率作為響應值，各取3個水平，進行三因素三水平響應面優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平與編碼

1.4 當歸揮發油抗氧化性的測定

參考羅秋水等的測定方法[18]，并作出略微修改。

1.4.1 DPPH自由基溶液的配制

精確稱取6 mg DPPH標準品，置于100 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，配成0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液，冷藏待用[19]。

1.4.2 當歸揮發油樣品溶液的配制

取適量的揮發油置于100 mL的容量瓶中，用無水乙醇將樣品配制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的樣品溶液。分別取2 mL以上樣品溶液，置于離心管中，分別加入2 mL 0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液，混勻后避光靜置30 min，再用分光光度計分別測定混合溶液在517 nm處的吸光度，記為a1，用無水乙醇代替DPPH標準品溶液，517 nm處測定吸光度，記為a2，用無水乙醇代替樣品溶液，相同條件下測定吸光度，記為a0，見式(2)。陽性對照采用與樣品質量濃度相同的抗壞血酸(維生素C)對照品溶液。

DPPH自由基清除率=[1-(a1-a2)/a0]×100%。

(2)

1.5 數據分析

利用Design-Expert 10.0以及Excel 8.0軟件對試驗數據進行分析處理，每個樣品3次重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，當歸粒徑24 目、加水倍數6倍、提取時間7 h時揮發油提取率均最高。當歸粒徑大于24目時，當歸顆粒與水的接觸面積較小，顆粒內部揮發油難以蒸出；而粒徑小于24 目時，粒徑較小，接觸面積過大，藥材顆粒與水充分接觸后內部含有的多糖、內酯類等小分子物質經水煎煮后極易被提取出來，導致水中的黏性物質增多，造成當歸藥材顆粒發生黏結、成團現象，不利于揮發油的蒸出，同時燒瓶底部還會有少量顆粒粘在瓶壁，出現焦糊現象，這也可能是揮發油量損失的原因之一。加水過多會使揮發油在水中部分溶解，而加水過少無法充分浸潤當歸藥材；提取時間縮短，顆粒內部的有效成分不能完全溶出，而時間過長提取率變化不大且會提高生產成本，耗時、費力。綜上所述，各個因素的改變均會造成揮發油提取率的下降。因此，為了綜合考量揮發油提取工藝參數，本試驗結合單因素結果進行后續響應面分析。

圖1 當歸粒徑、加水倍數、提取時間對揮發油提取率的影響Fig.1 Effects of the particle size of angelica granules, water addition factor,and extraction time on the extraction rate of volatile oil

2.2 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，并考慮實際生產需要的條件。以當歸粒徑(A)、加水倍數(B)、提取時間(C)為自變量，以揮發油提取率為響應值設計試驗，試驗方案及結果見表2。采用Design Expert 10.0軟件對試驗數據進行二次響應面回歸分析，得出當歸揮發油提取率與各因變量的模擬方程為：

Y=0.55-0.006 625A+0.007 875B+0.015C-0.001 500AB-0.002 250AC+0.002 250BC-0.029A2-0.020B2-0.013C2。

表2 響應面試驗方案及結果

表2(續)

2.3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

根據表3可知，回歸模型P值<0.001，處在極顯著水平，表明該模型顯著回歸，方程可以確切表明揮發油提取率與各因素之間的關系。表中多元相關系數R2=0.989 2，表明該回歸方程具有極高的可信度；失擬項P=0.061 9>0.05，表示極不顯著，證明了該回歸模型與試驗擬合度極高。表中A2、B2、C2各項的P值都小于0.05，均對響應值結果影響顯著。根據F值可以看出影響揮發油提取率的因素由大到小順序為提取時間、加水倍數、當歸粒徑。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

2.4 響應面及等高線分析

等高線圖和響應面圖可以直觀地反應出各因素交互作用對揮發油提取率的影響，等高線中的圓形表示兩因素交互作用不太明顯，而橢圓形則表示兩因素的交互作用比較明顯[20-21]。如圖2所示，提取時間與粒徑兩者的等高線圖呈橢圓形，交互作用較為顯著，而當歸粒徑與加水倍數、提取時間與加水倍數的等高線圖均呈現出圓形，表明兩者交互作用不顯著。

圖2 因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of factor interaction

2.5 當歸揮發油工藝驗證

響應面法得出該模型最優解：當歸粒徑20.248目、加水倍數6.246 倍、提取時間7.757 h。根據藥典規定并結合實際生產條件，將工藝條件修正為：當歸粒徑24目、加水倍數6 倍、提取時間7 h，在此條件下提取3批當歸揮發油，見表4。結果表明了上述工藝參數條件準確可靠，具有實際生產價值。

表4 工藝驗證實驗結果

2.6 當歸揮發油抗氧化性試驗結果

由圖3可知，當歸揮發油從0.2 mg/mL增加到1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率從12.7%增加到51.9%，即揮發油抗氧化性對樣品質量濃度有一定依賴性。圖中可以發現，使用相同質量濃度的維生素C代替樣品質量濃度時，DPPH自由基清除率高于當歸揮發油，維生素C對DPPH自由基的清除率一直處于較高水平。結果表明了當歸揮發油抗氧化能力比對照品維生素C差，當歸揮發油的IC50為0.953 mg/mL。

圖3 當歸揮發油對DPPH自由基的清除作用Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of A. sinensis volatile oil

3 結果與討論

為了有效提高當歸藥材的使用價值，本試驗以當歸藥材為研究對象，利用響應面法對當歸揮發油提取工藝進行優化。優選出的工藝參數如下：當歸粉碎粒徑24目，加水倍數6倍，提取時間7 h，在此條件下揮發油提取率可達到0.538%。然后，對該當歸揮發油進行DPPH自由基的清除率研究，結果表明當歸揮發油具有一定的抗氧化性，樣品質量濃度在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范圍內時，DPPH自由基清除率與當歸揮發油的質量濃度呈顯著的正比量效關系，當歸揮發油質量濃度為1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率最高。此研究為當歸藥材的提取工藝摸索出最優條件，結果參數穩定、可行。本試驗使用響應面法優化了當歸揮發油的提取工藝并測定了其抗氧化活性，旨在為揮發油的進一步開發利用提供理論指導，為當歸臨床應用范圍的擴展提供新的思路。