基于網絡藥理學和分子對接研究丹參治療漿細胞性乳腺炎的作用機制

潘伍亮，張姜宇，許春燕，曾熠，潘宗宇，游元元

(成都醫學院 藥學院，四川成都 610500)

漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis，PCM)亦稱乳腺導管擴張癥，是以導管擴張、導管周圍炎癥及漿細胞浸潤為基礎的一種乳腺慢性非細菌性炎癥，臨床表現為乳頭溢液，乳暈下腫塊、乳房局部疼痛不適，化膿潰破后易反復發作形成瘺管, 經久難愈[1-2]。目前西醫治療以藥物和手術為主，但藥物治療效果不盡如人意，而手術切除則不僅會影響乳房外觀，還有較高的復發率[3-4]。中醫將PCM歸于乳癰的范疇之內，認為該病為肝氣郁結、血瘀凝聚所致[5]，治療手段有以中藥復方為主的內治法，也有包括引流法、墊棉法、箍圍法等的外治法[6]。

在PCM的內治法中丹參使用頻率較高[7]。國家級名中醫周玉朱教授的經驗方——丹參化瘀湯對此病有良好的治療效果[8]，消乳散結湯、蒲公英柴胡湯、柴芩消癰湯等臨床治療PCM的方劑中亦含有丹參。五代時期典籍《日華子本草》記載丹參具排膿止痛、生肌長肉之功效，后世本草對該功效多有記載；宋代劉明之在《圖經本草藥性總論》中記載了丹參具有排膿止痛、治惡瘡疥蘚的功效；明代李中梓在《醫案必讀》《頤生微論》《本草通玄》等多部著作中均強調了丹參散結的作用；《本草綱目》丹參項下則記載了以丹參為君藥治療婦人乳癖的方劑。

丹參所含化合物甚多[9]，但治療PCM的物質基礎并不明確。目前對于丹參的研究多集中在心腦血管疾病的治療或預防方面，對PCM 的治療機制研究甚少。基于此，本研究采用網絡藥理學和分子對接分析丹參中有效成分對PCM的作用機制，以期為丹參治療PCM的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 獲取丹參的藥物活性成分及其潛在作用靶點

以“丹參”為關鍵詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ，TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中搜尋丹參的有效化學成分[10-11]，根據TCMSP數據庫得到的篩選結果，設置篩選條件藥物口服生物利用度(oral relative bioavailability，OB)≥30%，設置類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[12-15]。在TCMSP數據庫中找到并下載藥物活性成分潛在靶點。利用UniProt數據庫( https://www.uniprot.org/)對查詢到的藥物活性成分靶點進行靶點蛋白和基因信息校正，得到丹參有效成分的預測靶點。

1.2 構建中藥-成分-靶點網絡

將1.1篩選得到的丹參的所有有效活性化合物及其對應的靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建得到中藥-成分-靶點網絡，確定合適的分析條件，分析得到丹參的主要活性化合物及主要作用靶點。

1.3 篩選PCM的疾病靶點并構建藥物-成分-靶點-疾病網絡

利用GeneCard數據庫(https://www.genecards.org/)以及DisGeNET數據庫( https://www.disgenet.org/)，搜集PCM的相關靶點基因，對GeneCard數據庫取 Score值大于中位數的靶點作為PCM的潛在靶點[16]，對DisGeNET數據庫設置篩選條件為相關系數(Relevance score)≥1，限定研究物種為人類，對兩數據庫篩選出的疾病靶點進行整合去重，并剔除潛在致病靶點中在人體乳腺細胞內不表達的基因靶點，得到PCM的高關聯性靶點。利用UniProt數據庫將查詢到的疾病靶點轉換為UniProt ID，通過BioinfoGP數據庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools.html)的在線工具Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關靶點基因取交集，得到丹參治療PCM關鍵靶點[17]。并使用1.2得到的中藥-成分-靶點網絡與PCM的高關聯性靶點相映射，利用Cytoscape3.7.2軟件將結果可視化，構建藥物-成分-靶點-疾病網絡。

1.4 交集治療靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)是指從生物體內各種作用角度研究蛋白質之間的相互作用關系。將潛在治療靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，選擇中置信度(minimum required interaction score=0.150)選項，構建交集治療靶點的PPI網絡，導出數據于Cytoscapoe3.7.2軟件中分析。了解潛在治療靶點的互作信息，以degree值確定其中相對重要的靶點。

1.5 靶點的基因本體功能富集分析

將篩選得到的潛在作用靶點導入DAVID數據庫v6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，以p≤0.05為篩選條件，選定研究條件限定為人類，進行基因本體( gene ontology， GO)生物過程、細胞組成、分子功能富集，并分析數據得到GO功能富集圖。

1.6 靶點的KEGG通路富集分析

利用DAVID數據庫v6.8、Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.htm)和KEGG API數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/rest/)進行京都基因與基因組百科全書 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集，探究丹參作用于PCM可能的生物功能和信號通路。對于每個給定的基因列表，通路和過程富集分析使用以下本體來源進行：KEGG Pathway、Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、CORUM、DisGeNET、PaGenBase、Transcription factor target、TRRUST、PANTHER Access和WikiPathways分析。基因組中的所有基因都被用作富集背景，利用KEGG API數據庫對所有潛在基因組的表達通路進行篩選。根據P(P< 0.01)[18]、最小計數為3 且富集因子> 1.5(富集因子是觀察到的計數與偶然預期的計數之間的比率)收集靶點基因，并根據其成員相似性將其分組到集群中。使用Cytoscape3.7.2對數據進行可視化網絡分析[19]，將其中每個節點代表一個作用靶點基因，以P大小著色，將Cytoscape3.7.2得到的視圖網絡與Metascape數據庫得到的基因列表分析報告結果進行對比，得到PCM可能的生物功能和信號通路。

1.7 分子對接

為進一步確認潛在疾病治療靶點與丹參有效成分的作用關系，選擇潛在作用靶點互作程度排名前三的編碼蛋白，在Protein Data Banks(PDB數據庫)(https://www.rcsb.org/)上查找其作用三維結構，保留為PDB格式，使用autodock4.0軟件(基于Python語言-使用Python3.7軟件)與丹參主要活性化合物進行分子對接。以對接成功的蛋白和分子的結合自由能作為判斷方式，若結合自由能最強，則兩者親和力越大，越有可能實現分子與蛋白相互作用。

2 結果

2.1 丹參主要活性成分和相關靶點

通過TCMSP數據庫檢索共得到丹參活性化合物丹參65種，其中可結合靶點的有效成分共計59種，部分丹參有效活性成分見表1(全表見OSID科學數據與內容附表1)。同時通過TCMSP數據庫檢索得到丹參潛在作用靶點132個。

表1 部分丹參活性成分

2.2 中藥-成分-靶點網絡的構建

基于Cytoscape3.7.2軟件分析結果，得到丹參的中藥-成分-靶點網絡(圖見OSID科學數據與內容附圖2-A)， 網絡共計191個節點，其中活性成分59個，藥物靶點132個，含有961條邊。以度值(degree)(可體現網絡中交互能力大小)作為判斷依據。可得木樨草素的度值最大為54，其次依次為丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內脂、丹參酮，其度值分別為40、38、36、34。說明這5種藥物成分為丹參中作用靶點較多的重要活性成分。

2.3 篩選PCM潛在致病靶點構建藥物-成分-靶點-疾病網絡

由GeneCard數據庫以及DisGeNET數據庫搜集整合的PCM的相關靶點基因,經過篩選，共有125個靶點與PCM相關聯。將所有篩選得到的疾病靶點與丹參有效活性成分作用靶點相映射，得到藥物-成分-靶點-疾病網絡(圖見OSID科學數據與內容附圖2-B)。Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關靶點基因取交集，得到丹參治療PCM關鍵靶點分析網絡并繪制Venn 圖(圖1)，分析結果得到潛在治療靶點共有10個，分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3。其中PGR、NR3C1、BCL2L1等3個基因度值最高，分別為8、7、3，且其發生作用分子多為丹參的有效成分。

圖1 丹參成分靶點與PCM疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn Diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma component ingredient targets and PCM disease targets

2.4 構建潛在治療靶點PPI

根據STRING數據庫分析結果(圖2)，利用Cytoscape7.2.0分析其數據，可知此網絡圖共10個節點，42條邊，平均節點度值為8.4。依據度值排名，前4名分別為BCL2L1、IL-6、ICAM1和PGR，說明這4個靶點具有更強的交互作用，對疾病的影響更大。經過進一步文獻[20-23]篩選確定，丹參對PCM治療的作用靶點主要為IL-6、ICAM1和PGR。

圖2 潛在作用靶點PPIFig.2 PPI network of potential target

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID數據庫對10個潛在治療基因進行富集分析，得到14個生物過程(biological process，BP)、9個細胞組成(cell composition，CC)、6個分子功能(molecular function,MF)，具體結果見分析圖(圖見OSID科學數據與內容附圖2-C)。其中生物過程主要涉及細胞對藥物反應的調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、趨化因子的正向調控、MAP激酶活性陽性調控等；細胞成分主要為細胞質、外側質膜,細胞核等；分子功能主要分為細胞因子活性、蛋白質結合、 RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性 DNA 結合等。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果篩選得到16條信號轉導通路，包括乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等，有關于PCM以及乳腺癌的通路共計兩條；第一條，通過直接影響Her-2或其他間接因素，放大PI3K激活PI3K信號通路，影響細胞增殖、存活、翻譯等生物過程，進而影響細胞分裂周期和細胞生物學過程，誘發炎癥或癌變；第二條，Jagged或Delta通過影響Notch，使Notch信號通路的Her-2過度表達，Her-2/neu在某些乳腺癌和卵巢癌細胞表面過度表達[24]，是乳腺癌變的標志。總體結果見圖3。對關聯炎癥反應、凋亡、氧化應激反應進行分析[25]，通過對富集因子、P值及參與調控通路上的基因數進行綜合富集通路分析，得到各潛在靶點對生物生理功能的調節過程，結果按照P值大小著色(-logP>10著深橙色，6<-logP<10著橙色，-logP<6著淡橙色)繪制疾病靶點基因KEGG通路富集分析圖，見圖4。

注：相關信號通路采用紫色標記。圖3 丹參有效成分與乳腺癌及炎癥信號通路的相關靶點示意圖Fig.3 Schematic diagram of the relevant targets of the active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and the breast cancer and inflammation signaling pathways

注：按照P值大小著色，-log P>10著深橙色，6<-log P<10著橙色，-log P<6著淡橙色。圖4 疾病靶點基因KEGG通路富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of the enrichment analysis of disease target genes KEGG pathway

2.7 分子對接結果

為了進一步驗證上述篩選的關鍵成分與重要靶點的準確性，取藥物-成分-靶點-疾病網絡中度值前五的有效活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內脂、隱丹參醌與篩選出的潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、PGR、ICAM1的靶點蛋白進行相互結合實驗，以結合自由能作為篩選條件，結果15次對接嘗試均獲得成功，其結果均小于0，且結合自由能都在-8.368～-20.627 12 kJ/mol范圍內，其中木樨草素與3種蛋白分子對接后結合自由能最小(圖5)，分別為-16.275 76 kJ/mol(圖5(a))、-18.325 92 kJ/mol(圖5(b))及-20.627 12 kJ/mol(圖5(c))，由分子對接結果可知木樨草素與疾病靶點結合最為容易且穩定。說明木樨草素可能是治療PCM疾病過程中一個重要的活性成分，這就為進一步的研究提供了理論依據。

圖5 木樨草素與基因的分子對接圖Fig.5 Molecular docking map of luteolin and the gene

3 討論與結論

本研究利用網絡藥理學和分子對接方法研究了丹參治療PCM的活性成分，并識別出其中關鍵的靶點及其調控的 KEGG 通路和GO生物學過程。

通過構建藥物-成分-靶點-疾病網絡以及分子對接驗證，顯示丹參的活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內脂、隱丹參醌與潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、P6GR、ICAM1靶點基因對應的蛋白確有分子結合的可能。其中，木樨草素可與6個潛在治療靶點(BCL2L1、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6)產生相互作用，提示木樨草素可能在PCM治療過程中發揮重要作用。此外，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、鼠尾草酚酮、二氫丹參內脂、隱丹參醌、丹參酮因能與較多的疾病靶點交互，初步推測其可能在治療PCM中發揮一定作用。

通過將丹參活性成分靶點與PCM靶點映射后，得到10個潛在治療靶點，分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3，值得后續深入研究。其中NR3C1、PGR在10個潛在基因靶點中互作的丹參活性成分最多，同時也是degree值最高的兩個基因，提示二者的靶點與丹參有效成分交互作用最強。對潛在治療靶點構成的PPI進行分析，可得到互作程度居于前兩位的靶點基因PGR(NR3C3)、IL-6。其中IL-6可介導IL-6產生，IL-6是由活化的單核巨噬細胞、B細胞等細胞分泌產生，是人體內促炎細胞因子和抗炎性肌細胞因子[26]，IL-6作為抗炎細胞因子的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的活化來介導的[27]，并通過一系列生物效應從而刺激人體免疫應答[28]，臨床將其作為一個PCM的重要指標[29]，也有研究表明外界因素是通過IL-6/JAK2/STAT3途徑誘發PCM[30]，故丹參可能通過抑制此途徑發揮治療作用。PGR基因是編碼類固醇受體超家族的一個成員，負責編碼蛋白質介導孕酮的生理效應。孕酮在妊娠有關的生殖事件中起著核心作用，是否與PCM相關需要進一步研究[31-34]。

GO富集分析表明丹參可能的作用機制為調節體內細胞對藥物反應、增加一氧化氮在體內的含量、介導產生趨化因子、激活并加強MAP激酶活性、增強IL-6受體的拮抗等，KEGG富集分析表明丹參也可能是通過乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等對PCM進行治療。而在NF-κB通路中，若藥物能抑制NF-κB活性，便可抑制細胞因子TNF-α，作為PCM另一關鍵指標TNF-α，藥物若能降低其在病灶的表達水平，則此藥物對PCM就具有良好治療效果[35-36]，說明此通路是丹參作用于PCM的一條作用通路。通過對NF-κB通路的分析，側面反映了丹參也可能通過上述其余通路作用于PCM。

綜上所述，中藥丹參治療PCM是通過多成分、多靶點、多途徑共同調控的結果。本研究初步揭示了其治療PCM的物質基礎和可能的作用機制。在的后續研究中，將對本研究篩選的關鍵靶點和信號通路進行體內外的實驗驗證。