纖維素降解菌的篩選及對玉米秸稈降解的影響

張鵬飛，孟會生，井國雁，陳澤坤，馬曉楠

(山西農業大學資源環境學院，山西太谷 030801)

我國秸稈資源種類豐富、分布廣泛。據統計，我國每年可以產生10.4億t的秸稈，占世界秸稈總產量的20%～30%[1]。目前我國處理秸稈多采用秸稈還田的方式。秸稈還田雖然能釋放有機物質改善土壤結構[2]，但秸稈中有大量的纖維素、半纖維素等，在自然狀態下降解比較長，在此期間有可能會影響種子的正常生長。如何合理利用秸稈，緩解農村能源物資缺乏嚴重的現象已經成為我國一個難題[3]。自2000年，我國就頒布了關于秸稈一系列如何利用和解決秸稈禁燒的政策[4]。但秸稈焚燒的現象還是隨處可見，因此如何合理使用秸稈并且提高秸稈的利用率仍然是社會關注的焦點。

相比較使用化學方式處理秸稈的方法，低成本、無污染的微生物降解方法更具有研究價值。微生物降解法是快速降解纖維素的一種快速有效的方法，主要利用土壤中原有的微生物，增加微生物酶的活性對秸稈進行降解。研究表明，正確合理使用微生物降解菌劑可以降低水稻秸稈的強度，明顯促進土壤中的養分、微生物多樣性等，從而使作物在一定程度上增產增收[5]，對農業可持續發展具有重要作用。

在自然環境中，纖維素降解菌的種類豐富且數量龐大，主要包括纖維黏菌和纖維桿菌等細菌，纖維放線菌、諾卡氏菌屬和霉菌屬等放線菌，木霉屬、曲霉屬、青霉素等真菌[6]。生存環境也各式各樣，如動物腸胃、土壤、森林等。研究表明，纖維素降解菌可增強土壤降解秸稈能力，對農業廢棄物有重要的作用。如纖維素轉化商用酶作用于玉米秸稈等不同種類的木質素原料[7]；從臧牛胃中分離出來2株纖維素降解菌作用于青貯飼料，結果發現纖維素菌落可改善飼料品質。雖然菌類資源豐富，但目前發現的可實際應用于農田并降解秸稈的較少。該研究主要是通過試驗篩選與構建高效纖維素微生物菌群，加快玉米秸稈還田速度，對合理利用秸稈資源、減少環境污染具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集。土壤樣品采自山西省晉中市太谷區山西農業大學資源環境學院試驗田(含枯枝落葉、腐敗秸稈、動物糞便等的土壤)。

1.1.2培養基。菌株的篩選和分離采用羧甲基纖維素培養基和赫奇遜液體培養基[8]；保存菌株采用液體LB培養基[9]；初篩菌株纖維素能力采用濾紙條培養基[10]。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離、篩選。稱取采集的樣品土10.00 g,并在無菌條件下放于裝有90.00 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻并靜置，稀釋成10-5、10-62個濃度菌液。用移液槍取0.1 mL 10-5稀釋液涂布于好氧性纖維素分解培養基平板上，同樣的方法取10-6稀釋液并涂布。每個稀釋度涂布3個平板，30 ℃培養箱培養5 d左右。每個菌落挑選單個菌株置于好氧性纖維素分解培養基,每皿2個，然后1 mol/L剛果紅染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗，在12、24、36 h測定每個菌落直徑(d)和其產生水解圈直徑(D)，并計算水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)。水解圈與菌落直徑比值可以簡單判斷該菌株的纖維素降解能力。

1.2.2菌株的鑒定。對篩選出的菌株進行生理生化鑒定[11]，同時利用16S rDNA測得基因通用引物(S10:5′-AAGTCGAACGATGAACCA-3′、S20:5′-GCAGTCGAACGATGAAGC-3′、S30：5′-AAGTCGAACGATGAAGCC-3′)擴增菌株的16S rDNA基因片段。運用NCBI Blast分析工具對測序結果進行比對，從而鑒定菌株。

1.2.3玉米秸稈降解試驗。將粉末狀500 g的玉米秸稈放在花盆里，置于30 ℃的環境中，試驗設7個處理，分別為CK(不加菌劑，加等量清水)、S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S10S20S30，每盆加入10 mL菌劑，每隔2 d觀察玉米秸稈干物質降解率，培養20 d后，測定總碳、纖維素、半纖維素含量。干物質降解率=(發酵前的干物質量-發酵后的干物質量)/發酵前干物質量×100%。

1.2.4測定方法。采用水解圈和菌落直徑比值、濾紙條的降解效果2種方法進行初篩菌株。菌株纖維素酶、內切葡聚糖酶、濾紙酶(FPA)活力參照劉東陽等[12]的方法進行測定。

纖維素采用范氏法-重量法[13]進行測定；半纖維素采用2 mol/L鹽酸水解法和DNS法相結合[14]進行測定；總有機碳采用TOC分析儀法[15]進行測定。

1.3 數據統計與分析采用Excel 2019對原始數據進行整理，采用SAS對試驗結果進行方差分析，并用 Duncan′s 新復極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選纖維素降解菌分解纖維素能力以水解圈與菌落直徑的比值來判定。從分離的10株菌株初步篩選3株纖維素降解能力較強的S10、S20、S30。由表1可知，S10、S20、S30這3個菌株水解圈與菌落直徑的比值(D/d)隨著時間的增加而增加。菌株S10和S20的水解圈和菌落直徑的比值較大，培養36 h比值分別為6.12和6.02，而S30的比值為4.52，遠遠小于S10和S20。

表1 纖維素降解菌的水解圈直徑(D)、菌落直徑(d)及其比值

2.2 不同菌株的濾紙降解效果與纖維素酶活性以定性濾紙為底物初步研究纖維素降解菌的分解能力，結果如表2所示。纖維素分解菌S10菌株和S20菌株具有較強的濾紙分解性能，靜置3 d后可以清晰地觀察到濾紙有明顯的降解，5 d 后培養基開始變黃，到第7天濾紙條明顯開始崩解。S30菌株在第3天沒有明顯的變化，到第5天開始濾紙條降解，到第7天培養基才開始變黃。由此可見，S10、S20菌株纖維素降解能力強于S30菌株。

對S10、S20、S30纖維素降解菌進行復篩，將3株纖維素降解菌發酵培養72 h后，測其纖維素酶的活性，結果發現，3株纖維素降解菌中S10的纖維素酶活性最大，為65.38 U/mL，其次為S20菌株，纖維素酶活性為59.29 U/mL，S30菌株纖維素酶活性最小，為45.74 U/mL。S10菌株比S20、S30菌株纖維素酶活性分別高6.09、19.64 U/mL。綜上所述，S10單菌株纖維素酶活性遠遠強于S20和S30，因此可選擇S10單菌株進行后期試驗。

2.3 分子生物學鑒定對S10、S20、S30菌株進行16S rDNA鑒定，結果顯示(圖1)，S10、S30與栗褐鏈霉菌多個菌株具有高度的同源性，S20與枯草芽孢桿菌多個菌株具有高度的同源性。因此鑒定S10、S30為栗褐鏈霉菌，S20為枯草芽孢桿菌。

圖1 基于16S rDNA纖維素分解菌S10(A)、S20(B)、S30(C)的系統發育樹

2.4 不同菌株組合對玉米秸稈降解效果的影響從不同菌株及其組合對玉米秸稈干物質降解的影響(圖2)可以看出，不同單菌株和1∶1混合雙菌株以及1∶1∶1混合三菌株作用玉米秸稈，與對照相比，均有明顯的降解效果，玉米秸稈的干物質降解率隨時間的延長而增長。在前期，各處理玉米秸稈干物質降解率增長較快，在4～6 d時，不同菌株及其混合菌株組合對玉米秸稈干物質降解率均較快，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分別增長49.89%、48.42%、47.47%、51.06%、57.00%、55.11%、53.69%，混合菌株處理玉米秸稈干物質降解率均高于單菌株的，增長最快的是1∶1混合雙菌株S10S30；在后期，各處理玉米秸稈干物質降解增長趨勢開始減緩，在6～8 d時，不同處理間的降解增長趨勢均較慢，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分別增長1.44%、1.26%、3.66%、9.59%、5.43%、6.82%、9.17%，增長最緩慢的是單菌株S20；在8～10 d，玉米干物質降解率雖有增長，但增長趨勢不明顯。如圖2所示，混合三菌株S10S20S30對玉米秸稈干物質降解率均為最高，可用于后期試驗。

圖2 不同菌株組合對玉米秸稈干物質降解率的影響

2.6 不同菌株組合對玉米秸稈的纖維素、半纖維素和總有機碳含量的影響測定玉米秸稈中纖維素、半纖維素、有機碳含量可以清晰反映菌株對玉米秸稈的降解作用，進而挑選優質菌株應用農田生態系統，解決秸稈堆肥的問題。從不同菌株對玉米秸稈中纖維素、半纖維素、總有機碳含量的影響(表3)可以看出，S10、S20、S30不同單菌株和1∶1混合雙菌株以及1∶1∶1混合三菌株S10S20S30處理后，與對照相比均差異顯著，玉米秸稈的纖維素、半纖維素、總有機碳的含量均有明顯的下降趨勢；S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30處理玉米秸稈，其纖維素含量與對照相比分別下降了14.74%、11.54%、7.80%、26.79%、23.27%、19.83%、27.21%，半纖維素含量分別下降了14.46%、9.42%、7.82%、19.36%、17.80%、14.23%、20.02%，總有機碳含量與對照相比分別下降了4.65%、3.50%、1.85%、7.59%、8.68%、9.68%、11.55%。綜上所述，混合三菌株S10S20S30對玉米秸稈的纖維素、半纖維素、總有機碳含量影響最大，單菌株S30為最弱，可選擇S10S20S30用于后期的試驗。

表3 不同菌株組合對玉米秸稈的纖維素、半纖維素和總有機碳含量的影響

3 討論與結論

秸稈還田過程中使用纖維素降解菌劑可提高農作物秸稈的降解速度，可以有效解決秸稈還田和堆肥問題[16]。耿麗平[17]研究發現在農田施加纖維素降解菌培養30 d時使小麥植株生物量增加16.8%，常勇等[18]研究表明水稻中后期秸稈還田不僅增加水稻產量，還改善土壤理化性質。多數研究表明秸稈降解改善土壤理化性質，為植株根系正常生長發育提供良好的環境和所需的營養成分，從而增加作物產量[19-21]。該試驗采用赫奇遜培養基分離纖維素降解菌，利用剛果紅平板法和濾紙崩析程度來篩選纖維素降解菌，這樣不僅可以保證篩選的菌株具有高效的纖維素分解能力，而且還能保證菌株的純化度；最后篩選出3株纖維素降解能力較強的單一菌株，根據16S rDNA基因序列分析結果，并且結合菌株的形狀、大小、顏色等確定S10為栗褐鏈霉菌、S20為枯草芽孢桿菌、S30為栗褐鏈霉菌。

秸稈中纖維素結構較為復雜，降解纖維素是多種酶共同作用的效果。該試驗通過不同菌株作用玉米秸稈，測其纖維素、半纖維素、總有機碳含量的變化。結果發現，雖然單菌株S10、S20、S30與對照相比有很好地降解玉米秸稈纖維素的效果，但混合菌株比單菌株有更好的作用效果，尤其是1∶1∶1混合三菌株效果最好；這可能是3種菌株有協同作用，增強了降解纖維素的能力。這與宮玉勝等[22]研究發現的混合菌株纖維素能力增強是高度相似的。該試驗僅1∶1∶1混合三菌株作用于玉米秸稈，其他配比或者加入其他種菌株和其他降解纖維素物質，其降解纖維素能力增強還是減弱仍然還需要后期試驗進行驗證；并且該菌株作用于實際田間，是否對土壤的理化性質發生改變仍然需要進一步證明。

綜上所述，混合菌株作用玉米秸稈的纖維素降解能力顯著高于單菌株；其中混合三菌株S10S20S30的降解纖維素能力最強，可作為高效纖維素降解菌，加快秸稈還田，減少環境污染，在降解玉米秸稈方面也有較大的開發前景。