一種免疫調節肽的小鼠經口急性毒性試驗

焉 揚,魯令華,劉曉東,杜恒裔,邵 坤,王述柏*

(1.青島農業大學動物醫學院,山東青島 266109;2.青島農業大學動物科技學院,山東青島 266109)

生物活性肽是對機體的生命活動有一定生理作用的肽類化合物,相對分子質量小于6 000 D[1-2],其分子結構復雜程度不一[3],是一類介于氨基酸和蛋白質之間的多肽[4]。1902年,英國科學家Bayliss等[5]首次發現了生物活性肽,自此國內外學者對活性肽開展了大量研究[6]?；钚噪母鶕砉δ芸煞譃槊庖哒{節肽、抗菌肽、血壓調節肽、神經活性肽、呈味肽等[7-8],其中免疫調節肽因其獨特的免疫增強作用備受研究者關注[9-10]。Xu等[11]從中華小公魚胃蛋白酶產物中篩選出具有免疫調節活性的五肽YVMRF,研究發現這種肽能促進小鼠RAW264.7細胞系分化,增加一氧化氮(NO)、白細胞介素-6、白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的產量。葉盛旺等[12]從青蛤胃蛋白酶產物中篩選出的活性肽免疫調節活性高,能顯著增強小鼠巨噬細胞系RAW264.7的吞噬能力、NO的分泌水平和細胞因子的分泌量。Li等[13]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚蛋白得到多肽ACNGR,發現這種肽能提高環磷酰胺誘導小鼠的免疫器官指數,促進脾淋巴細胞的增殖,增加與腸黏膜免疫相關的SIgA、IgA、IL-6、IL-10的分泌,從而增強小鼠腸道黏膜的免疫功能，可見免疫調節肽有望成為動物抗生素類飼用添加劑的替代物。但是，對新型飼用添加劑開展毒理學評價是其推廣應用前必不可少的。符大勇等[14]研究了海洋生物表面活性肽(SPR)的急性毒性,試驗期間小鼠無任何中毒癥狀、無死亡,經大體病理學觀察發現臟器無異常變化,因此確定SPR對小鼠無毒性。劉泳廷等[15]利用小鼠的急性毒性試驗研究野生盔孢傘中鵝膏毒肽的毒性,結果顯示小鼠出現不同程度的中毒癥狀,隨鵝膏毒肽劑量的增加肝細胞腫脹、壞死,伴有出血和炎細胞浸潤的病變逐漸加重,確定小鼠半數致死量(LD50)為108 mg/kg。筆者以小鼠為實驗動物，研究了一種新合成免疫調節肽的急性毒性,旨在為其安全性評價和推廣應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料免疫調節肽:白色粉末,純度不低于98.5%，由青島農業大學預防獸醫學研究室制備。小鼠配合飼料及墊料，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 實驗動物54只體重相近(24～26 g)的清潔級ICR系小鼠,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.3 試驗時間和地點試驗于2017年5月在青島農業大學實驗動物房和預防獸醫學研究室進行。

1.4 試驗方法采用急性毒性試驗的限量法[16]進行試驗設計,將54只小鼠飼養于實驗動物房內觀察、適應5 d,在此期間自由采食飲水；確認健康無病后,將小鼠隨機分為3組(Ⅰ、Ⅱ組為試驗組,Ⅲ組為對照組),每組18只(雌雄各半),公母分籠飼養。所有小鼠飼養條件、飲用水、飼料保持一致。實驗動物房內室溫20～25 ℃,濕度50%～70%,通風良好,并保持衛生清潔。

通過預試期試驗獲得小鼠適宜灌胃量為0.2 mL/只,根據實測體重計算每只小鼠免疫調節肽的使用量,準確稱取待檢樣品并將其溶于蒸餾水中。試驗組Ⅰ和Ⅱ分別灌胃劑量200和400 mg/kg 的免疫調節肽溶液0.2 mL,對照組灌胃等量蒸餾水。灌喂前禁食6 h,只供應飲水,給予受試物后繼續禁食2 h。

1.4.1臨床觀察。試驗期間,每天觀察小鼠皮膚、被毛、眼、黏膜組織以及呼吸系統、泌尿生殖系統、消化系統和神經系統等組織器官有無異常變化,記錄動物發生異常變化的時間、程度以及持續時間,評估可能發生毒性作用的靶器官或組織,精確記錄死亡時間和死亡時體重。觀察試驗期間各組織器官的異常變化，判定依據參見文獻[17]。連續觀察14 d。

1.4.2生長性能測定。于試驗開始當日和試驗期末,準確稱量試驗小鼠體重,每日準確記錄加料重、剩料重,計算每日采食量。最后，計算試驗期間平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.3病理學檢查。所有小鼠(包括試驗過程中死亡小鼠、試驗結束時處死小鼠)均進行大體解剖，觀察并記錄小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胃、腸、睪丸或卵巢的病理學變化;大體解剖病理改變時，進一步進行病理組織學觀察;準確稱量各器官重量,計算臟器系數：臟器系數=臟器重量/體重。

1.4.4血液生理學指標檢測。

1.4.4.1血樣采集。于試驗期結束日(第14天),采用摘眼球采血法采集血樣,一部分用于檢測血常規指標,另一部分離心分離血清,用于檢測血清生化指標。

1.4.4.2血常規指標檢測。使用全自動流式血細胞計數儀檢測,檢測指標包括白細胞總數、淋巴細胞比率、中性粒細胞比率、淋巴細胞數目、中性粒細胞數目、紅細胞總數、血紅蛋白含量、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度變異系數、紅細胞分布寬度標準差、血小板總數、平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板壓積。

1.4.4.3血清生化指標檢測。采用全自動生化分析儀和試劑盒檢測,檢測指標包括血清丙氨酸氨基轉移酶活性、天冬氨酸氨基轉移酶活性、堿性磷酸酶活性、谷氨?；D移酶活性以及總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、膽固醇、尿素、肌酐和葡萄糖含量。試驗所用試劑盒均購自北京安普生化科技有限公司。

1.5 數據處理試驗數據采用Excel軟件初步整理后,使用SPSS 17.0統計軟件的單因素方差分析和Duncan法進行組間差異顯著性比較。試驗結果均以“平均值±標準差”表示。結果分析參考文獻[18]的方法。

2 結果與分析

2.1 臨床觀察結果試驗期間各試驗組和對照組小鼠的眼部(圖1)、鼻孔(圖2)、母鼠的乳房(圖3)、母鼠的陰部(圖4)、公鼠的陰部(圖5)以及小鼠的被毛(圖6)均未出現異常變化,呈健康狀態。

圖1 小鼠的眼部變化

圖2 小鼠的鼻孔變化

圖3 母鼠的乳房變化

圖4 母鼠的陰部變化

圖5 公鼠的陰部變化

圖6 小鼠的被毛變化

2.2 大體解剖病理學檢查結果解剖觀察各組小鼠的內臟器官(包括胃、腸、肝、脾、腎、心臟、睪丸、卵巢),發現均無臨床病理學變化(公鼠見圖7,母鼠見圖8),呈健康狀態。

圖7 公鼠的腸、脾、心臟、胃、腎、睪丸和肝

圖8 母鼠的脾、肝、卵巢、心臟、胃、腎和腸

2.3 免疫調節肽對小鼠生長性能的影響由表1可知，試驗組Ⅱ公鼠末重和平均日增重略高于對照組和試驗組 Ⅰ(P>0.05),料重比分別較對照組和試驗組 Ⅰ低0.77和0.40,但各組公鼠始重和末重無顯著差異(P>0.05),試驗期間各組公鼠的平均日采食量和料重比亦無顯著差異(P>0.05)。由表2可知，各組母鼠始重無顯著差異(P>0.05)；試驗組Ⅰ、Ⅱ的母鼠末重、平均日增重均顯著高于對照組(P<0.05),各組平均日采食量和料重比均無顯著差異(P>0.05)。觀察期間，各組公鼠和母鼠均無死亡。

表1 各組公鼠生長性能的比較

表2 各組母鼠生長性能的比較

2.4 免疫調節肽對小鼠血常規指標的影響由表3可知,各組小鼠的白細胞總數、淋巴細胞比率、中性粒細胞比率、淋巴細胞數目、中性粒細胞數目、紅細胞總數、血紅蛋白含量、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度變異系數、紅細胞分布寬度標準差、血小板總數、平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板壓積均無顯著差異(P>0.05)。

表3 各組小鼠血常規指標的比較

2.5 免疫調節肽對小鼠血清生化指標的影響由表4可知,各組血清丙氨酸氨基轉移酶活性、天冬氨酸氨基轉移酶活性、堿性磷酸酶活性和谷氨酰基轉移酶活性無顯著差異(P>0.05),各組血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、膽固醇、尿素、肌酐和葡萄糖含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組小鼠血清生化指標的比較

續表4

2.6 免疫調節肽對小鼠臟器系數的影由表5可知,各組公鼠、母鼠的臟器系數(包括肝、脾、腎、心臟、胃、腸)均差異不顯著(P>0.05),各組母鼠的卵巢系數及公鼠的睪丸系數亦無顯著差異(P>0.05)。

表5 各組小鼠臟器系數的比較

3 討論

急性毒性試驗標準GB 15193—2014規定:無毒或毒性微小的受試物適合采用限量法試驗設計[16]。生物活性肽屬于此類受試物[18-19],因此該試驗采用限量法試驗設計檢測免疫調節肽的急性毒性作用。周雯等[20]研究了一種生物活性肽粉對小鼠的急性毒性,結果顯示經口急性毒性LD50大于10 000 mg/ kg。徐軍等[21]通過急性毒性試驗研究了芽孢菌肽的毒性,觀察動物的中毒表現和死亡時間，并進行毒性判斷,雌、雄小鼠的經口急性毒性LD50分別為5 010和7 940 mg/kg。李函頻[22]以小鼠為實驗動物,研究了融合肽hEGF-AWRK6的急性毒性,結果顯示觀察期間小鼠無死亡,給藥組的臟器系數、精子畸形率、血常規指標與空白對照組相比均無顯著差異,因此認為融合肽hEGF-AWRK6無急性毒性。宋淑敏等[23]研究了漢麻籽多肽粉的急性毒性,發現連續14 d的觀察期內試驗小鼠未見任何中毒癥狀,亦無死亡發生；對小鼠進行大體病理學觀察,未見臟器異常改變,因此確定漢麻籽多肽粉對小鼠的經口急性毒性LD50大于20 000 mg/kg。該試驗結果表明,受試小鼠臨床觀察發現各組織器官無任何異常變化,受試物免疫調節肽對公鼠生長性能無不良影響,可顯著提高母鼠體重增長,受試小鼠血常規指標及血清生化指標與對照組均無顯著差異；大體解剖觀察發現，受試小鼠內臟器官發育正常,無病理變化,與對照組相一致。該試驗結果表明免疫調節肽對小鼠未產生急性毒性作用,與上述報道結果相一致。

4 結論

該試驗所用免疫調節肽對小鼠無急性毒性作用,最大耐受劑量(MTD)大于5 000 mg/kg。