帕勒隆尼氏假單孢菌HG-258發酵條件和培養基的優化

劉 芳，王 英，楊 陶，黃大野

(湖北省生物農藥工程研究中心，湖北武漢 430064)

黃瓜是我國日常消費的主要蔬菜品種，位居保護地栽培面積第一位，在保障蔬菜周年供應中占有舉足輕重的地位。2015年我國黃瓜種植面積 125.8萬hm2，產量5 938 萬t，均居世界首位[1-2]。猝倒病是黃瓜育苗及移栽期間的主要病害，是世界著名的毀滅性病害，可造成爛種、爛芽及幼苗猝倒。特別是在氣溫低、土壤濕度較大時發病嚴重，在溫室及大田均可造成嚴重的危害[3-4]。一般發病率20%～50%，嚴重地塊可達 80%以上，近年來猝倒病已成為影響黃瓜生產的首要問題。猝倒病的病原菌主要為卵菌綱瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，生產上還沒有針對猝倒病的高抗品種，化學藥劑仍是猝倒病防治的主要手段。但隨著藥劑的使用抗藥性迅速出現，導致藥劑失效[5]。同時，化學殺菌劑的使用會造成農藥殘留和環境污染，危害人畜健康。因此，開發生物活性高、對非靶標生物安全和環境相容性好的新型殺菌劑具有重要意義。

植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是一類在農業生產中具有重要應用價值的微生物[6]。帕勒隆尼氏假單孢菌(Pseudomonaspalleroniana)最早從水稻中分離并鑒定[7]，具有較為廣譜的農用生物活性，包括促進蘑菇生長[8]、促進植物生長[8-9]，但也有報道P.palleroniana菌株可抑制擬南芥的生長[10]。針對黃瓜苗期猝倒病，筆者從黃瓜苗期根際土壤中分離到P.palleronianaHG-258菌株，其對黃瓜苗期猝倒病有明顯的防控效果，具有開發潛力。對該菌株的生長特性、發酵條件及培養基優化等方面的研究，有助于提高該菌株的發酵水平，為該菌株的工業化生產提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試菌株帕勒隆尼氏假單孢菌(Pseudomonaspalleroniana)HG-258菌株由湖北省生物農藥工程中心從黃瓜苗期根際土壤樣品中分離得到并保存。

LB 培養基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0。基礎發酵培養基：葡萄糖 10 g，蛋白胨15 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。發酵培養基：根據需要具體配制，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1種子液制備。將斜面菌種接種1環至LB液體種子培養基中，30 ℃、180 r/min 培養 12 h。

1.2.2菌數測定。采用稀釋涂布平板計數法。

1.2.3發酵培養基的優化。①碳源。分別用 10 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉和玉米淀粉5種碳源作為唯一碳源，基礎發酵培養基中的其他組分蛋白胨含量不變，pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養 32 h 后測定發酵液的菌數，確定最佳碳源。②氮源。固定碳源葡萄糖10 g/L，分別以15 g/L 魚粉、豆粕、蛋白胨、酵母膏、花生粕、芝麻粕和玉米漿7 種氮源作為唯一氮源進行發酵培養，玉米漿用量按干物質含量折算。pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養 32 h 后測定發酵液的菌數，確定最佳氮源。③正交試驗。在單因素試驗的基礎上，以甘油和蔗糖為碳源，豆粕、酵母膏為氮源，無機鹽固定為硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，設計4因素3水平正交試驗(表 1)，pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養 32 h 后測定發酵液的菌數。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.4發酵條件的優化。在選用最適培養基條件下，分別考察不同溫度、pH、接種量、轉速對HG-258菌體生長的影響。

1.2.5生長曲線。在最適培養基和最佳培養條件下搖床振蕩培養 48 h。培養期間每隔 4 h 取液態樣品測定菌數并涂片鏡檢。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的優化

2.1.1碳源。從圖1可以看出，不同碳源對HG-258菌株菌體生長有不同的影響，其中甘油和蔗糖作為碳源的效果較好，發酵結束后菌數為 1.574×1010和1.682×1010CFU/mL，因此選擇甘油和蔗糖為HG-258菌株發酵培養基的碳源。

圖1 不同碳源對HG-258菌株生長的影響

2.1.2氮源。由圖 2 可知，HG-258菌株在含有豆粕和酵母膏的培養基中菌數較高，發酵結束后菌數為 1.762×1010和1.886×1010CFU/mL，因此選擇豆粕、酵母膏作為HG-258菌株發酵培養基的氮源。

圖2 不同氮源對HG-258菌株生長的影響

2.1.3正交試驗結果。由表2和表3可知，影響HG-258菌株發酵水平主次因素關系為蔗糖>甘油>酵母膏>豆粕，蔗糖的F為2.718，對發酵的影響最大，而豆粕對發酵的影響較小。HG-258菌株的最佳發酵培養基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，此配方在pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min條件下培養 32 h，HG-258菌株的發酵菌數可達 2.544×1010CFU/mL。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

2.2 發酵條件的優化

2.2.1溫度。由圖3可知，HG-258菌株在28 ℃培養條件下菌數最高，可達2.544×1010CFU/mL。

圖3 不同培養溫度對HG-258菌株生長的影響

2.2.2起始pH。由圖4可知，HG-258菌株在培養基起始pH 7.0條件下菌數最高，可達2.526×1010CFU/mL。

圖4 不同起始pH對HG-258菌株生長的影響

2.2.3接種量。由圖5可知，在一定范圍內，HG-258菌株發酵液中的菌數隨接種量的增加而增加，但當接種量> 5% 時，菌數呈下降趨勢。因為 3% 接種量和 5% 接種量菌數差別不大，從經濟角度出發，在后續試驗中選擇3%的接種量為佳。

圖5 不同接種量對HG-258菌株生長的影響

2.2.4轉速。由圖6可知，隨著搖床轉速的增加，HG-258菌株的菌數也隨之增加，但200和220 r/min條件下菌數差別不大。從經濟角度出發，將HG-258菌株的培養搖床轉速確定為 200 r/min。

2.3 生長曲線由圖7和鏡檢情況可知，HG-258菌株的生長規律：0～4 h 延滯期，菌數很少；4～24 h 對數生長期，菌體呈桿狀，數量迅速增加，24～36 h 穩定期，32和36 h菌數相差不大，桿狀菌體大量脫落形成球狀菌體，32 h時98%的菌體形成整齊的球狀菌體，因此32 h左右是最佳培養結束時間，36 h以后進入衰亡期。

圖7 HG-258菌株的生長曲線

3 結論與討論

對具有防病促生活性的生防微生物發酵培養基及培養條件的優化可推動生防微生物的深入評價及生防產品的開發。不同微生物菌株的營養需求不同，可通過不同的試驗設計對其發酵培養基及培養條件進行優化。在假單孢菌發酵培養基篩選中，多采用蛋白胨、甘油、葡萄糖等作為發酵的碳源及氮源[11-14]。從該研究結果看，帕勒隆尼氏假單孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株對緩效碳源，如玉米粉及玉米淀粉的利用不好，而蔗糖、葡萄糖及甘油有利于菌體的生長，這與其他的研究結果一致。在氮源利用上，HG-258菌株對花生粕、芝麻粕及玉米漿等氮源利用不好，但豆粕、酵母膏及蛋白胨等有利于菌體的生長，特別是在以豆粕為氮源的培養基中生長與在以酵母膏為氮源的培養基中生長相當，這為降低HG-258菌株發酵成本提供了可能。HG-258菌株發酵的最適溫度范圍較廣，有利于發酵過程中溫度的控制。從發酵培養基的pH對菌體生長的影響來看，pH對生長的影響較大，最適pH為7.0。接種量從1%～5%，菌數與接種量呈正相關，而隨著接種量進一步上升，發酵液菌數則下降。發酵轉速反映了發酵過程中的溶氧量，作為一種好氣性細菌，HG-258菌株需要較高的溶氧，要采用較高的轉速200～220 r/min。HG-258菌株生長較快，發酵36 h就達到了生長高峰。該研究確定了帕勒隆尼氏假單孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株的最適培養基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L。對發酵條件優化確定了HG-258菌株的最佳發酵條件是初始 pH 7.0，培養溫度 28 ℃，接種量 3%，轉速 200 r/min 搖床振蕩培養。在最佳發酵條件下，搖瓶發酵液菌數可達 2.826×1010CFU/mL，相比初始培養基及培養條件下的發酵水平提高了約1倍。所采用的培養基原料來源廣泛，價格低廉易獲取，為該菌株的進一步產業化開發奠定了基礎。