大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因的篩選及GmEXPA17a的克隆和表達分析

王玉斌，張彥威，劉薇，李偉，王彩潔，戴海英，徐冉，張禮鳳

(山東省農業科學院作物研究所/山東省特色作物工程實驗室，山東 濟南 250100)

植物在生長發育過程中經常遭遇干旱、冷害和土壤鹽漬化等非生物脅迫的危害，其中鹽脅迫是植物受到的主要非生物脅迫之一[1]。由于長期以來人類不合理灌溉加上氣候條件的劇烈變化，我國耕地鹽堿化程度不斷惡化，嚴重威脅我國糧食安全和農業可持續發展。大豆是我國重要的糧油飼兼用作物，在保障國家糧食安全中具有重要的地位。雖然大豆屬于中度耐鹽作物，但鹽脅迫會嚴重影響大豆生長，降低大豆產量與品質[2]。因此，通過育種改良培育抗鹽大豆品種，實現鹽堿地大豆產量與品質的協同提高，對緩解目前我國面臨的糧食安全具有重大意義。

擴展蛋白(expansin)是一類參與調控細胞壁擴張和細胞生長的活性蛋白，廣泛存在植物體內，參與調控眾多植物生長發育與生理過程，包括種子萌發、根系發育、莖和葉的生長、氣孔移動和果實軟化等[3]。而且擴展蛋白通過調控細胞壁松馳在植物適應環境脅迫過程中起著關鍵作用[4]。通過系統進化樹分析一般可以將擴展蛋白分為四個亞家族，分別為α－expansin(EXPA)、β－expansin(EXPB)、expansin－like A(EXLA)和expansinlike B(EXLB)[5]。其中EXPA 和EXPB 家族蛋白已被證明會引起細胞壁的松弛[6]。擴展蛋白一般由250～275 個氨基酸組成，典型的擴展蛋白通常包含N端結構域、C 端結構域和信號肽結構域[3]。

越來越多的證據表明擴展蛋白基因參與不同植物對鹽脅迫的響應[7]。超表達AtEXP3和AtEXPB1可增加擬南芥對鹽脅迫的敏感性[8]；月季RhEXPA4在擬南芥中過量表達可以通過促進側根發育提高其抗鹽性[9]；玉米中已報道ZmEXPA1、ZmEXPA3、ZmEXPA5、ZmEXPB1和ZmEXPB2通過調控細胞擴展減少鹽脅迫對玉米造成的離子毒害[10]；在煙草中超表達小麥EXPA2基因可以通過降低Na＋/K＋含量，提高抗氧化能力從而增加煙草抗鹽性[11]；OsEXPA7通過協調Na＋轉運、ROS 清除和細胞壁松弛，提高水稻抗鹽能力[12]。大豆基因組中共有75 個擴展蛋白基因家族成員[13]，第一個被發現的擴展蛋白基因是在根中表達的α－expansin 家族基因GmEXP1，其過表達可促進煙草細胞和根的生長[14]。β－expansin家族的GmEXPB2受磷脅迫誘導，主要在根中表達，其過量表達通過提高根毛長度影響根系磷的吸收[15，16]。但目前關于大豆擴展蛋白基因參與鹽脅迫響應還未見報道。

本研究利用實驗室前期篩選出的耐鹽大豆品種齊黃34[17]，對不同時間點鹽脅迫處理的根系進行轉錄組測序分析，鑒定出7 個持續響應鹽脅迫的擴展蛋白基因，并對響應鹽脅迫較強的GmEXPA17a進行了克隆、生物信息學分析、組織表達分析、鹽脅迫和激素應答分析，為進一步研究擴展蛋白基因在大豆鹽脅迫響應中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

大豆材料為耐鹽品種齊黃34。使用艾德萊RNA 提取試劑盒提取齊黃34 根部RNA，pLB 零背景快速克隆試劑盒和膠回收試劑盒以及菌液鑒定用到的2×TaqPCR MasterMix 購自天根生化科技(北京)有限公司，DH5α 感受態細胞購于濟南雨碩生物科技有限公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑和基因克隆用到的高保真酶均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養及處理 大豆種子經10%次氯酸鈉(V/V)消毒20 min 后，用蒸餾水清洗5 遍。將消毒好的種子均勻放置在濕潤的濾紙上催芽。3 d 后挑選生長一致的幼苗轉移至底部有網眼的塑料筐中，塑料筐放置于盛有改良1/2Hoagland營養液的塑料盆中，保持根充分浸入營養液中，并用通氣泵通氣。試驗在山東省農業科學院作物研究所光照培養室進行，培養溫度為25℃/22℃日/夜，光照時間為16 h/d，濕度控制在50%～60%。待真葉展開，挑選長勢一致的幼苗轉移至盛有5 L 改良Hoagland 營養液的塑料盒中進行培養，通氣24 h，6 d 后用150 mmol/L NaCl 處理，分別在0、1、3、6、12 h 取根部組織，每個時間點3 次生物學重復，樣品提取RNA 后由北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序分析。另外進行鹽處理轉錄組數據驗證，分別在0、1、3、6、9、12 h 取地上部和地下部，每個時間點3 次生物學重復。

激素處理試驗:真葉展開后轉移至5 L 改良Hoagland 營養液中，3 d 后換新的營養液并在其中分別加入10 μmol/L 乙烯合成前體1－氨基環丙烷－1－羧酸(1－aminocyclopropane－1－carboxylic acid， ACC)、 100 μmol/L 脫落酸(ABA)、 10 μmol/L 赤霉素(GA3)。在激素處理0、1、3、6、9、12 h 取根部組織，每組處理均為3 次生物學重復。

1.2.2 大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因的鑒定對轉錄組進行分析，將P－adjust value<0.05 且的擴展蛋白基因定為差異表達基因，篩選4 個時間點均響應鹽脅迫的大豆擴展蛋白基因。將差異擴展蛋白基因在擬南芥TAIR 數據庫中進行BLAST，分值最高的擬南芥基因作為每個大豆擴展蛋白基因的同源基因。

1.2.3 大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因上游順式作用元件分析 利用差異表達擴展蛋白基因ID號從Phytozome(https:/ /phytozome－next.jgi.doe.gov/)數據庫中提取基因起始密碼子上游1 500 bp 啟動子序列，使用在線軟件PlantCare(http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析上游可能存在的順式作用元件。利用GSDS 2.0 在線網站(http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)[18]進行順式作用元件的可視化。

1.2.4GmEXPA17a基因的克隆 提取齊黃34 根系組織RNA，并反轉錄成cDNA，具體操作步驟參考試劑盒說明書。從Phytozome 中下載GmEXPA17a的CDS 序列并設計克隆引物，引物由擎科生物技術有限公司合成，引物序列為GmEXPA17a－F:5′－ATGGGAAAGTTCATTTTGAG－3′和GmEXPA17a－R:5′－ GAACTGGACATTGCTGGTGA－3′。以cDNA 為模板，利用諾唯贊的KOD 高保真酶對CDS 全長進行克隆。PCR 反應體系(15 μL):2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，Primer F 0.3 μL，Primer R 0.3 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 5.4 μL，反應程序:95℃3 min；95℃15 s，56℃30 s，72℃1 min，共35 個循環；72℃5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將長度762 bp 的片段切膠回收，利用天根pLB 零背景快速克隆試劑盒將目的片段與pLB 載體連接后轉化大腸桿菌DH5α，菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱過夜培養，挑取單克隆進行菌液PCR 擴增鑒定，陽性克隆搖菌后送往青島擎科生物科技有限公司進行測序，測序成功后利用DNAMAN 軟件進行序列比對。

1.2.5 GmEXPA17a 的生物信息學分析 采用在線軟件GSDS 2.0 進行GmEXPA17a基因結構的繪制；在NCBI 中(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行GmEXPA17a 保守結構域分析；利用在線分析軟件ExPASy(https:/ /web.expasy.org/compute＿pi/)計算GmEXPA17a 蛋白的分子量和等電點；利用SOMPA 軟件(https:/ /npsa－prabi.ibcp.fr/cgi－bin/npsa＿automat.pl? page ＝npsa＿sopma.html)預測其二級結構；使用NetPhos 3.1(https:/ /services.healthtech.dtu.dk/service.php? NetPhos－3.1)軟件進行磷酸化位點預測；利用TMHMM Server v.2.0(http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構域預測；氨基酸序列在NCBI 中進行BLAST，選取分值較高的氨基酸采用DNAMAN 軟件與GmEXPA17a進行序列比對。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT－PCR) 利用NCBI 網站中的Primer－Blast 在線軟件(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer－blast/index.cgi? LINK＿LOC ＝BlastHome)設計用于檢測基因GmEXPA17a表達量的特異性引物，引物序列為qGmEXPA17a－F:5′－TCAGGGGCACTTCCATTGTT－3′和qGmEXPA17a－R:5′－ ACACCAGCCACCATTGTCATT－3′。以大豆GmActin為內參基因，引物序列為qGmActin－F:5′－CGGTGGTTCTATCTTGGCATC－ 3′和qGmActin－R:5′－GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA－3′。提取不同組織部位、鹽脅迫處理、激素處理和對照樣品的RNA 并反轉錄成cDNA。以稀釋10 倍的cDNA 為模板，利用諾唯贊生物科技有限公司的TB green premix ExTaq試劑盒進行熒光定量PCR 體系的配置，在羅氏480 熒光定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR 檢測，每個樣品進行3 次重復。反應程序:95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s， 40 個循環。利用2－ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2010 進行數據處理和繪圖。用SAS 9.0(SAS Institute Ltd.， USA)進行顯著性統計分析。差異顯著性利用Fisher’s LSD(P<0.05)進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因的篩選

對耐鹽品種齊黃34 根系進行鹽脅迫處理，以未經鹽處理的根系樣品為對照進行轉錄組測序，通過分析共篩選到7 個擴展蛋白基因在4 個處理時間點表達量發生顯著變化。如表1 所示，鹽脅迫處理顯著誘導GmEXPA17a、GmEXPA17b、GmEXPA17c、GmEXLB1a和GmEXLB1b五個基因的表達，其中GmEXPA17a和GmEXLB1a響應程度較大。GmEXPA10和GmEXPA12基因的表達在鹽處理后呈下降趨勢。

表1 大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因

2.2 鹽脅迫響應擴展蛋白基因啟動子分析

在Phytozome 上下載7 個持續響應鹽脅迫的大豆擴展蛋白基因起始密碼子前1 500 bp 的啟動子序列，輸入到PlantCare 在線軟件中對啟動子進行順式作用元件分析。結果發現這些基因的啟動子上存在多個與非生物脅迫及植物激素應答元件相關的順式作用元件，包括干旱誘導響應元件(MBS)、脅迫響應(TC－rich)、脫落酸(ABRE)、乙烯(ERE)、赤霉素(P－box)和生長素響應(TGAelement)元件(圖1)。統計發現，7 個擴展蛋白基因啟動子上均含有脫落酸響應元件。

圖1 大豆鹽脅迫響應擴展蛋白基因啟動子順式作用元件示意圖

2.3 GmEXPA17a 的克隆和生物信息學分析

本研究對α－expansin 家族響應鹽脅迫程度最大的基因Glyma.19G222900.1(GmEXPA17a)進行了分析。該基因位于第19 號染色體，基因序列全長1 298 bp，其中開放閱讀框762 bp，含有3 個外顯子和2 個內含子(圖2A)。從齊黃34 的根部克隆了GmEXPA17a基因的CDS 序列全長，并連接到pLB 載體上進行轉化與測序，結果發現齊黃34 中GmEXPA17a的開放閱讀框序列與大豆威廉姆斯82 的參考基因組序列完全相同。該基因編碼254 個氨基酸，CDD 結構域分析發現，GmEXPA17a 的第1～254個氨基酸為PLN00193 結構域(圖2B)。生物信息學分析結果表明，其蛋白質平均分子量和等電點分別為27 921.83 Da 和9.72。蛋白質二級結構預測結果表明，GmEXPA17a 蛋白由10.24%的α 螺旋、53.15%的無規則卷曲、28.74%的延伸鏈和7.87% 的β 轉角構成(圖2C)。磷酸化位點預測分析發現，GmEXPA17a 蛋白共有磷酸化位點Tyr 2 個、Ser 15 個、Thr 4 個(圖2D)。GmEXPA17a 蛋白含有典型的跨膜結構域，推測為膜定位蛋白(圖2E)。

圖2 GmEXPA17a 的生物信息學分析

將GmEXPA17a 的氨基酸序列在NCBI BLAST 中進行查找比對，其與刺毛黧豆、野生大豆、木豆、豇豆和赤豆等豆科作物的擴展蛋白相似度較高。對其進行氨基酸序列相似性比對，發現GmEXPA17a 與野生大豆(XP＿028217735.1)的擴展蛋白相似度最高，相似度達到99.61%。各個擴展蛋白基因的氨基酸序列在氨基端和羧基端的保守性較高(圖3)。

圖3 GmEXPA17a 氨基酸與其它豆科植物擴展蛋白氨基酸序列的比對

2.4 GmEXPA17a 對鹽脅迫處理的響應

為了驗證轉錄組試驗數據的準確性，重新對齊黃34 進行不同時間鹽脅迫處理，然后取地上部和地下部樣品進行GmEXPA17a表達量檢測，以未添加NaCl 處理的0 h 作為對照。結果如圖4所示，鹽處理顯著誘導不同時間點大豆地上部和地下部GmEXPA17a基因的表達，無論在地上部還是地下部，GmEXPA17a對鹽脅迫響應較快，處理1 h 后顯著上調。與地上部相比，鹽處理對地下部GmEXPA17a誘導量較大，鹽處理3 h 后，地上部GmEXPA17a表達量變化較小(圖4)。

圖4 鹽處理后地上部和地下部GmEXPA17a 基因的相對表達量

2.5 GmEXPA17a 表達模式分析及對不同激素處理的響應

取齊黃34 不同部位，利用RT－qPCR 檢測GmEXPA17a基因的表達模式，結果如圖5 所示。GmEXPA17a在大豆多個組織中均有表達，其中在根中的表達量最高。

圖5 GmEXPA17a 基因在不同組織部位的相對表達量

用不同植物激素處理齊黃34 幼苗，取根部進行GmEXPA17a表達量檢測，結果如圖6 所示。脫落酸(ABA)處理條件下，GmEXPA17a的表達量在1、3、6、9、12 h 均顯著上調，處理9 h 時達到最高；與ABA 處理相似，乙烯合成前體(ACC)處理同樣顯著誘導GmEXPA17a表達，ACC 處理6 h時GmEXPA17a表達量最高，之后逐漸下降；GmEXPA17a對赤霉素(GA3)響應較快，處理3 h達到最高值，然后逐漸下降。這些結果表明GmEXPA17a的啟動子上含有脫落酸、乙烯和赤霉素響應元件，能夠調控其表達。

圖6 不同激素處理后GmEXPA17a 基因的相對表達量

3 討論與結論

土壤鹽漬化嚴重影響大豆的生長和干物質積累，造成產量的下降。植物細胞壁對抵御生物和非生物脅迫起著重要的屏障作用[7，19]。擴展蛋白作為一種細胞壁蛋白，在植物響應鹽脅迫和干旱過程中發揮重要作用。目前已報道大豆中擴展蛋白通過調控根系發育參與磷脅迫和干旱脅迫響應[15，20]。然而，擴展蛋白在大豆鹽脅迫響應中的功能未見報道。

本研究通過對齊黃34 大豆根系鹽處理后不同時間點的轉錄組進行分析，鑒定出7 個持續響應鹽脅迫的擴展蛋白基因。啟動子分析發現，這7 個基因的啟動子上均含有植物激素或脅迫應答元件。植物激素通過信號轉導途徑調控下游鹽脅迫響應基因的表達，廣泛參與到滲透脅迫、ROS平衡和Na＋轉運等植物耐鹽過程中，其中研究較多的是植物激素ABA[21]。本研究結果表明，這7個持續響應鹽脅迫的擴展蛋白啟動子上均含有ABA 應答元件(ABRE)，推測這些基因可能通過ABA 信號參與調控鹽脅迫響應。此外，這些擴展蛋白基因的啟動子上均至少含有乙烯和赤霉素信號元件，這兩種激素在調控植物根系發育中均發揮重要作用[22]，且目前已報道的大豆擴展蛋白主要通過調控根系發育參與到非生物脅迫反應中[15]。因此，我們推測大豆擴展蛋白可能通過植物乙烯和赤霉素信號調控根系構型參與到鹽脅迫響應中。

本研究從耐鹽品種齊黃34 中克隆了α 家族中對鹽脅迫響應程度最大的大豆擴展蛋白基因GmEXPA17a，該基因的表達在地上部和地下部均受到鹽脅迫的顯著誘導，而且地下部該基因對鹽脅迫響應較強烈。有研究表明，擬南芥擴展蛋白基因AtEXPA17(AT4G01630.1)正調控側根發育，AtEXPA17敲除會顯著抑制擬南芥側根的發育[14]。前人研究表明GmEXLB2通過調控大豆根系構型參與營養脅迫和干旱脅迫響應[15]。本研究中克隆得到的GmEXPA17a為擬南芥AtEXPA17的同源基因。因此，GmEXPA17a可能通過調控大豆側根的發育參與大豆鹽脅迫響應。通過對齊黃34 進行淹水處理后進行轉錄組測序篩選到了大量差異表達基因，發現GmEXPA17a在淹水處理的4 個時間點均顯著上調[23]。因此我們推測GmEXPA17a可同時響應鹽脅迫和澇漬脅迫，是研究大豆逆境脅迫響應的重要候選基因。組織表達分析發現GmEXPA17a基因在根、莖、葉和花中均有表達，在根中表達量最高。Zhu 等[13]通過轉錄組數據庫分析大豆擴展蛋白在不同組織器官中的表達發現，31%的大豆擴展蛋白基因屬于組織型表達，即在不同組織中表現出偏好性，只在特定的組織或器官中出現表達高峰，因此推測，GmEXPA17a 也屬于偏好性蛋白。

GmEXPA17a的啟動子中含有脫落酸(ABA)、乙烯合成前體ACC 和赤霉素(GA3)應答元件。實時熒光定量PCR 證明該基因的表達量在3 種激素處理后不同時間點均顯著上升，表明該基因受到激素的調控，可能參與了ABA、ACC和GA3的信號轉導途徑。高濃度鹽處理可以顯著誘導內源脫落酸含量的增加[24，25]，內源ABA 含量的升高可以提高水稻[26]、玉米[27]和菜豆[28]的耐鹽性。本研究中ABA 處理可以顯著誘導GmEXPA17a基因的表達，因此，GmEXPA17a對鹽脅迫的強烈響應很有可能是通過對脫落酸信號改變的感知而實現的。

本研究通過轉錄組測序篩選到7 個持續響應鹽脅迫的擴展蛋白，為今后研究大豆擴展蛋白基因家族在逆境脅迫響應過程中的功能提供了資源。同時，GmEXPA17a的克隆、生物信息學分析和激素應答分析為下一步研究其功能提供了理論基礎。