海南雪茄煙葉霉變微生物鑒定及拮抗菌株篩選

宋嘉寶，王明鋒，羅昭標，曹慶梅，夏長劍，侯寧寧，郭林青，馬 林，李 萌，陳德鑫*，饒 智*

1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136 號 450001

2. 紅云紅河煙草（集團）有限責任公司，昆明市紅錦路367 號 650231

3. 江西省煙草公司撫州市公司，江西省撫州市迎賓大道1666 號 344000

4. 湖北中向生物工程有限公司，湖北省宜昌市宜都市紅花套鎮 443300

5. 中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，?？谑屑t城湖路120 號 571100

6. 四川中煙工業有限責任公司，成都市成龍大道二段與成龍立交交叉口西南200 米 610021

煙葉具有較強的吸濕性且含有微生物生長繁殖所需要的糖類、蛋白質、有機酸等物質，在適宜的條件下容易滋生各種微生物而發生霉變［1-2］。據統計，每年我國煙葉因霉變造成的損失達70 億元左右［3-7］。引起煙葉霉變的微生物主要為真菌，包括曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Muor）和鏈格孢屬（Alternaria）等［8-13］霉變微生物。朱桂寧［14］發現曲霉屬微生物是引起廣西倉儲煙葉霉變的主要微生物，其次是青霉屬微生物。晏衛紅等［12］從廣西鐘山、富川和柳州等地煙倉霉變煙葉中分離出曲霉屬、青霉屬、毛霉屬和根霉屬霉變微生物，其中曲霉屬菌株為優勢菌群。煙葉霉變常見的防治方法為化學防治［15-16］、物理防治［17］和生物防治［18］。生物防治具有綠色、無公害且不易產生抗性等優點，已成為煙葉防霉重要的研究方向。趙文姬［18］運用混合平板法從烤煙煙葉表面分離出5株解淀粉芽孢桿菌，通過煙葉防霉試驗發現菌株B055具有很強的拮抗效果。朱大恒等［19］從煙草根際土壤分離出1 株對倉儲霉變菌株有較強拮抗效果的芽孢桿菌，可以影響霉菌的生長繁殖或使菌絲畸變。

近年來我國雪茄煙消費呈現高速增長趨勢，煙葉原料的持續供給是保障雪茄煙產業可持續發展的關鍵。雪茄煙葉在晾制、發酵和儲藏過程中普遍存在霉變現象，而目前煙葉霉變研究主要集中于烤煙和卷煙，有關雪茄煙葉霉變微生物鑒定及生物防治相關的研究報道較少。為此，從海南發生霉變雪茄煙葉上分離、純化霉變菌株，并篩選致霉菌的拮抗菌株，應用形態和分子生物學相結合的方法鑒定霉變微生物和拮抗菌株，旨在為雪茄煙葉霉變的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：雪茄煙葉（古引4號）采摘于海南省儋州市光村煙田，在海南省儋州市光村鎮建恒哈瓦那雪茄有限公司發酵房（平均溫度為30 ℃，相對濕度為80%）發酵380 d。采集典型霉變煙葉3.5 kg作為樣品。

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、無水乙醇、香柏油和溴化乙錠核酸染液（鄭州翼增生物科技有限公司）；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物、27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）通 用 引 物、ddH2O、瓊脂糖［生工生物工程（上海）股份有限公司］；2×Taq Plus Master Mix II（南京諾唯贊股份有限公司）；經121 ℃滅菌30 min 后的LB培養基（蛋白胨1 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉1 g、100 ml去離子水）。

儀器：DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti型梯度PCR儀（美國應用生物系統公司）；Mini Bis Pro型凝膠成像分析系統（以色列DNR凝膠成像系統有限公司）；Microfuge 20R 型高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；LX-C35L 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；N-300M型普通光學顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 海南霉變雪茄煙葉微生物的分離、純化和致霉性驗證

稱取霉變雪茄煙葉10 g，無菌操作接入盛有90 mL 0.9%無菌生理鹽水的錐形瓶中，加2 顆玻璃珠，30 ℃條件下180 r/min搖床震蕩30 min，得到原始菌懸液，按照10-2、10-3、10-4、10-5進行梯度稀釋后涂布于PDA 平板培養基，30 ℃恒溫培養箱培養72 h，純化2 代，得到單一的菌落，編號后置于4 ℃冰箱保存備用。

取適量雪茄煙葉置于培養皿中，121 ℃滅菌鍋滅菌20 min，將分離得到的霉變菌株接種于雪茄煙葉表面［13，20］，30 ℃培養5 d，觀察菌株對雪茄煙葉的致霉效果（煙葉霉變等級標準［13］：0級，未霉變；1級，葉柄發霉小于1 cm，葉片不發霉；2級，葉柄發霉大于1 cm，葉片不發霉；3級，葉柄發霉，葉片發霉面積為1%～25%；4級，葉柄發霉，葉片發霉面積為26%～50%；5 級，葉柄發霉，葉片發霉面積為50%以上），5 d 后，將煙葉表面霉變菌株接種于PDA 培養基中，觀察是否與原菌株一致。

1.2.2 霉菌的鑒定

菌株培養特征觀察：將分離得到的單一菌株分別接種至PDA平板培養基中央，于30 ℃恒溫培養箱培養，觀察菌落的形態特征并拍照。

ITS基因序列的PCR擴增和系統發育樹分析：用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取霉菌DNA。使用ITS1 和ITS4 通用引物對DNA 進行PCR 擴增（擴增程序：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；最后72 ℃延伸6 min）。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察產物條帶。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫進行BLAST同源性比對［21］。利用MEGA軟件構建系統發育樹。

1.2.3 拮抗菌株的篩選

從海南霉變雪茄煙葉未霉變部位篩選致霉菌拮抗菌。方法同1.2.1中致霉菌的分離與純化。

將得到的菌株分別與霉菌采用平板對峙法［19，22］進行培養。用打孔器取6 mm菌片接種于PDA培養基中央，篩分出的菌株劃線［19］接種于距霉菌2 cm處，單獨接種霉變菌株做對照實驗，每組菌株3個重復，30 ℃培養5 d，測量并得出平均值，計算R值（R=霉菌菌落向拮抗菌株生長的距離/對照菌落半徑），篩選出拮抗菌株并對其進行編號。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定

菌株生長特征的檢測：對分離得到的拮抗菌株使用平板劃線法分別接種到LB 培養基平板中，于30 ℃恒溫培養箱培養，觀察菌落的形態特征；挑取單菌落邊緣菌塊至滴有無菌水的載玻片上，用接種環將其涂抹均勻，對菌株進行革蘭氏染色［23］，顯微鏡下鏡檢并拍照。

分子生物學鑒定：使用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA。用27F和1492R通用引物對拮抗菌株進行PCR 擴增（擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后延伸7 min）。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物條帶是否正常。將PCR未純化產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將檢測序列拼接對齊后在NCBI數據庫中進行BLAST同源性比對。利用MEGA軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 海南霉變雪茄煙葉微生物菌落形態分析

通過平板涂布法分離純化得到3株霉變菌株，分別命名為MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，將菌株分別接種于PDA培養基30 ℃培養5 d后觀察。菌株菌落特征及鏡檢結果見圖1。菌株MBYY-A1 在PDA培養基中生長速度一般，菌落為圓形，菌落邊緣整齊，中心呈凸起狀，菌落表面呈粉末狀，菌絲頂部以及菌落邊緣呈白色，菌絲內部呈深綠色。在100倍油鏡下觀察，菌株孢子呈橢圓形，菌絲有隔膜，孢子與菌絲相連呈掃帚狀向外延伸。菌株MBYY-B1 在PDA培養基中生長速度較慢，菌落為圓形，邊緣整齊，菌落表面較為平整，菌絲長度較短，菌落整體呈土黃色，菌落邊緣呈白色。在100 倍油鏡下觀察菌株孢子呈圓形或橢圓形，菌絲有隔膜。菌株MBYY-C1在PDA培養基中生長速度緩慢，菌落為圓形，邊緣整齊，菌落表面不平整，呈棉絮狀，菌落整體呈白色，在100倍油鏡下觀察菌株孢子呈圓形，菌絲有隔膜。

圖1 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1菌落及鏡檢圖像Fig.1 Colonies and microscopic pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

霉變菌株在雪茄煙葉表面生長情況如圖2 所示。由圖可見，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 在無菌雪茄煙葉表面培養5 d 后，煙葉表面均出現大量霉變菌株菌絲，在煙梗處霉變菌株較多，根據1.2.1 中煙葉霉變等級的劃分可知3 株霉變菌株對煙葉的致霉性均達到4級。將霉變的煙葉中菌株接種至PDA 培養基中，可再次得到菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，并且無雜菌出現，證明3株霉變菌株均為雪茄煙葉致霉菌。

圖2 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1致霉性圖像Fig.2 Mold causing ability pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

2.2 霉變微生物的鑒定

PCR 擴增產物在550 bp 處有單一且明亮的條帶，可用于菌株鑒定。菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1 的系統發育樹如圖3～圖5 所示。BLAST比對 分析發現，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分別與其匹配菌株的序列相似度為100%、100%和99.82%，構建的系統發育樹見圖3～圖5，參考《真菌鑒定手冊》［24］相關形態學描述，初步確定菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分別為Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，分別屬于籃狀菌屬、帚霉屬和曲霉屬。

圖3 菌株MBYY-A1系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain MBYY-A1

圖4 菌株MBYY-B1系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain MBYY-B1

圖5 菌株MBYY-C1系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain MBYY-C1

2.3 拮抗菌株的分離、篩選與鑒定

2.3.1 拮抗菌株的分離與純化

通過平板涂布法和對峙平板法篩選出2 株對霉變菌株具有拮抗效果的菌株，編號為a和C25。平板對峙試驗菌株拮抗效果如圖6所示。經測量計算，可得菌株a 對MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分別為0.38、0.36 和0.4，菌株C25 對MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分別為0.33、0.32 和0.47，菌株a和C25拮抗效果良好。

圖6 菌株a和C25在PDA培養基中對菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of strains a and C25 against MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1 in PDA medium

2.3.2 拮抗菌株的鑒定

PCR擴增產物在1 500 bp處條帶明亮無明顯雜帶產生，可用于菌株鑒定。在100倍油鏡下菌株a和C25 鏡檢如圖7 所示，2 株菌株細胞均呈直桿狀、圓端，多以成對或鏈狀排列，革蘭氏染色結果為陽性。菌株系統發育樹如圖8和圖9所示，參考《常見細菌系統鑒定手冊》［25］可判斷菌株a 和C25 均為芽孢桿菌屬，分別為Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans。

圖7 菌株a和C25鏡檢圖像Fig.7 Microscopic pictures of strains a and C25

圖8 菌株a系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain a

圖9 菌株C25系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain C25

3 討論

從海南霉變雪茄煙葉中分離得到3 株對雪茄煙葉有較強致霉性的霉變菌株，經形態學和分子生物學鑒定分別屬于籃狀菌屬、帚霉屬和曲霉屬菌株，其中曲霉屬微生物是報道較多的煙葉致霉菌，在云南和廣西等地烤煙中均有類似報道［14，18］?；@狀菌屬由于其最初只包括能產生裸囊殼和青霉狀帚狀枝無性繁殖結構的物種，故而被放在青霉的分類框架中來研究［26］。黃福新等［27］從廣西煙倉霉變烤煙中分離出4 個屬的霉變菌株，其中就包括青霉屬菌株。而由帚霉屬引起的煙葉霉變目前還未見報道。

在霉變雪茄煙葉未霉變部位篩選出2 株對霉變菌株有良好拮抗效果的芽孢桿菌，可為雪茄煙葉霉變的生物防治提供參考。目前生物防治雪茄煙葉霉變報道較少，僅見高地芽孢桿菌防控雪茄煙發酵霉變的專利［28］。本研究中僅運用平板對峙法初步篩選出了拮抗菌株，并未將拮抗菌株應用于雪茄煙葉的發酵，未來可模擬雪茄煙葉發酵條件，將芽孢桿菌用于雪茄煙葉的發酵試驗，并對發酵條件進行深入研究。

4 結論

采用PDA培養基從海南霉變雪茄煙葉中分離出3株霉變菌株，經鑒定分別為Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，3 株霉變菌株對雪茄煙葉均具有很強的致霉性。從海南霉變雪茄煙葉中分離純化出2株拮抗菌株，2株拮抗菌株對霉變菌株的R值在0.32 ～0.47之間，菌株拮抗效果良好。經鑒定，2株拮抗菌株均為芽孢桿菌屬，初步鑒定為Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans，可作為雪茄煙葉霉變生物防治的候選菌株。