煙草種子附生細菌群落結構與多樣性分析

蔡劉體，謝紅煉，2，劉文鋒，汪漢成*，宋光龍，史彩華，曹亞凡，劉亭亭，2，孟建玉

1. 貴州省煙草科學研究院，貴陽市觀山湖區龍灘壩路29 號550081

2. 長江大學農學院，湖北省荊州市荊秘路266 號 434025

3. 湖北中煙工業有限責任公司技術中心，武漢市東西湖區金山大道1355 號 430040

4. 貴州省煙草公司銅仁市公司，貴州省銅仁市碧江區錦江北路41 號 564100

5. 上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區長陽路717 號西區 200082

煙草種子是煙草的重要器官，對煙草后代繁育具有重要作用。種子在發育與采收過程中，常攜帶包括病原菌在內的多種附生微生物。這些微生物通過附著在種子表面，直接或間接混雜于種子中［1］，使帶病種子成為煙草病害的初侵染源和傳播載體。煙草種傳病害包括真菌性、細菌性及病毒類病害，已報道的真菌性病害有煙草立枯病、煙草炭疽病等；病毒類病害有普通花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病等［2-3］；相比而言，煙草種傳細菌性病害種類較少，但其危害嚴重，常見有煙草野火病和煙草細菌性角斑病等［4］。種傳病害已成為種子生產加工、種衣劑研發的重點關注對象。

目前，煙草種子中有關細菌的相關報道較多，主要集中在內生細菌的研究方面。顏謹等［5］采用傳統分離法研究發現K326 種子的內生細菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等5 個屬。Chen 等［6］利用高通量測序技術發現4個煙草品種（畢納1、K326、PVH1452和云煙87）種子內生細菌的共有優勢菌門為變形菌門和厚壁菌門。謝紅煉等［7］試驗發現云煙87、云煙85和K326 種子的內生優勢細菌包括假單胞菌、埃希氏-志賀氏菌（Escherichia-shigella）等菌屬。分離培養與高通量測序技術是種子微生物研究的常用手段，作者前期對種子附生和內生真菌［7-9］進行了初步研究。而針對煙草種子附生細菌的深入研究卻鮮見報道［10］。為此，采用分離培養法對6個品種煙草種子附生細菌進行分離鑒定，并采用Illumina高通量測序技術對其中4個品種煙草種子的附生細菌群落結構與多樣性進行分析，旨在進一步了解煙草種子附生細菌的種群結構，為煙草種子附生細菌的研究利用及種子病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采用煙草裸種，品種為烤煙K326、云煙85、云煙87 和紅花大金元，雪茄煙301，白肋煙L8，均由貴州省煙草科學研究院提供，并置于-80 ℃冰箱中保存。

NA培養基：稱取蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉3.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g，加入1 000.0 mL純水中加熱溶解，調節pH 為7.3 ± 0.1，置于121 ℃條件下高溫滅菌20 min，備用。

1.2 可培養附生細菌分離與鑒定

1.2.1 可培養附生細菌分離

稱取各品種的裸種50 g，分別置于盛有250 mL無菌水的三角瓶中，170 r/min搖床振蕩培養2 h后過濾獲得種子洗滌液，備用。吸取各品種的種子洗滌液1 mL，進行10 倍梯度稀釋，將1×10-5、1×10-6和1×10-7倍的稀釋液涂布于NA平板上，并置于28 ℃條件下黑暗培養2 d。用無菌接種環蘸取NA平板上不同顏色、形態和生長速率的單菌落［11］，置于新的NA 平板上劃線純化，并將純化后的細菌置于20%的甘油溶液中于-20 ℃保存。

1.2.2 可培養附生細菌鑒定

利用細菌鑒定通用引物27F（5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）對分離的細菌進行菌落PCR 擴增［12］。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環；72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。擴增產物由賽默飛世爾科技有限公司測序，測序結果在NCBI上進行序列比對分析。

1.3 種子附生細菌群落結構與多樣性測定

1.3.1 種子附生微生物DNA提取

選取1.2.1 節中K326、云煙85、L8 和301 的種子洗滌液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，獲得種子附生微生物樣品，每品種3 次重復。K326、云煙85、L8 和301 種子附生微生物樣品編號分別為K326-1、K326-2、K326-3、Y85-1、Y85-2、Y85-3、L8-1、L8-2、L8-3和301-1、301-2和301-3。取各種子附生微生物樣品0.50 g，采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（美國Omega Biotek 公司）提取樣品總DNA，用NanoDrop 2000［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］檢測其濃度和純度。

1.3.2 16S rRNA文庫構建及高通量測序

參照謝紅煉等的方法［7］，以各種子附生微生物樣品基因組DNA 為模板，利用細菌通用引物779F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）擴增各樣品細菌16S rRNA基因的V5～V7區。反應體系（20 μL）：5×FastPfu 緩沖液4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，BSA 0.2 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL和DNA模板10 ng、ddH2O補足至20 μL。將合格擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rRNA 文庫構建與擴增子測序（Illumina MiSeq PE300）。

1.3.3 數據處理

將測序數據進行質控分析，將生成的OTU 比對Silva 數據庫（SilvaRelease132 https：//www.arb-silva.de/documentation/release-132），計算多樣性指數，并進行PCoA分析和聚類熱圖分析［13-14］。

2 結果與分析

2.1 種子附生可培養細菌分離與鑒定

從6 個煙草品種種子上共分離鑒定出可培養細菌35 株（表1），其中假單胞菌屬（Pseudomonas）9 株（25.71%），芽胞桿菌屬（Bacillus）7株（20%），腸桿菌屬（Enterobacter）6 株（17.14%），泛菌屬（Pantoea）4株（11.43%），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）2 株（5.71%），農桿菌屬（Agrobacterium）2 株（5.71%），新鞘酯桿菌屬（Novosphingobium）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、歐文氏菌屬（Erwinia）、短小桿菌屬（Curtobacterium）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）各1株（2.86%）。

表1 6個煙草品種種子附生細菌的分子鑒定結果Tab.1 Molecular identification results of adnascent bacteria on seeds of six tobacco cultivars

K326種子上的附生細菌有假單胞菌屬、歐文氏菌屬、短小桿菌屬和腸桿菌屬；云煙85種子上的附生細菌有假單胞菌屬和芽胞桿菌屬；云煙87上的有假單胞菌屬、腸桿菌屬、新鞘脂桿菌屬、鞘酯桿菌屬和寡養假單胞菌屬；L8種子上的有假單胞菌屬、腸桿菌屬、農桿菌屬和金黃桿菌屬；301 種子上的有泛菌屬和腸桿菌屬；紅花大金元種子上的有假單胞菌屬、鞘酯桿菌屬、腸桿菌屬和農桿菌屬。

2.2 附生細菌群落結構與多樣性分析

2.2.1 16S rRNA序列測序深度

4個品種的12個樣品測序結果（圖1）表明，隨著測序深度的增加，OTU 水平下的香農指數稀釋曲線趨于平緩，在測序序列數達到5 000 時，稀釋曲線已飽和。12個樣品共得到447 244條序列和200 011 454個堿基，所有序列的長度在266～559 bp 之間，平均長度為447 bp。

圖1 稀釋曲線（OTU水平Shannon指數）Fig.1 Rarefaction curve（Shannon index at OTU level）

2.2.2 煙草種子附生細菌群落多樣性

4個煙草品種種子附生細菌共含有337個OTU，分別來自16 個菌門、26 個細菌綱、57 個細菌目、103個細菌科、182 個細菌屬，共有263 個種。從OTU 分類水平來看，云煙85 種子上的附生細菌種類最多，為241 個；其次為L8（171 個）；K326（165 個）和301（164 個）相對較少，見表2。4 個品種煙草種子附生細菌共有的細菌屬和OTU 數量分別為48 和75 個，見圖2。

表2 4個品種煙草種子附生細菌不同分類水平數量Tab.2 Total amount of adnascent bacteria on seeds of four cultivars at different taxonomic levels （個）

圖2 4個品種煙草種子附生細菌群落Venn圖Fig.2 Venn diagram of adnascent bacterial communities on seeds of four tobacco cultivars

4個煙草品種種子附生細菌在豐富度指數、均勻度指數及多樣性指數上均存在共性與差異（表3）。多樣性大小排序依次為云煙85＞K326＞L8＞301，且各品種間存在顯著差異。豐富度指數（Sobs指數、Ace 指數、Chao 指數）表明4 個品種煙草種子附生細菌豐富度最大的為云煙85，最小的為301；K326 和L8種子附生細菌群落的豐富度差異不顯著，云煙85和301 與其他品種種子附生細菌群落豐富度存在顯著差異。4 個品種的均勻度和多樣性指數也存在差異，相比而言，K326 種子附生細菌均勻度較高，而301的較低；云煙85的多樣性指數相對較高。4個品種在覆蓋度指數上差異不顯著。

表3 4個品種煙草種子附生細菌Alpha多樣性指數（OTU水平）①Tab.3 Alpha diversity indexes of adnascent bacteria on seeds of four tobacco cultivars at OTU level

2.2.3 煙草種子附生細菌群落結構

所有OTU序列比對Silva數據庫顯示，煙草種子附生細菌主要分布于變形菌門（Proteobacteria，74.12%～94.61%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.43%～16.62%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.98%～7.05%）、放線菌門（Actinbacteria，1.16%～5.39%）和藍藻菌門（Cynobacteria，0.36%～3.17%），見圖3。

圖3 4個煙草品種種子附生細菌在門水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundances of adnascent bacteria on seeds of four tobacco cultivars at phylum level

4 個煙草品種種子附生細菌在屬的組成上存在一定的相似性，其中K326、L8和云煙85的附生細菌的組成和豐度更為相似，301的附生細菌在豐度上與其他品種存在差異性（圖4）。K326種子附生細菌群落中，假單胞屬占32.22%，泛菌屬占13.40%，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）占12.50%，腸桿菌屬占9.87%，糖芽胞桿菌屬（Saccharibacillus）占3.67%，寡養單胞菌屬占3.62%，根瘤菌屬占2.78%，蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）占2.21% ，類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）占1.31%，代爾夫特菌屬（Delftia）占1.27% ，Falsirhodobacter占 1.19% ，微桿菌 屬（Microbacterium）占1.04%。L8 種子附生細菌群落中，假單胞菌屬占27.60%，泛菌屬占12.87%，寡養單胞菌屬占8.76%，腸桿菌屬占7.90%，根瘤菌屬占3.55%，鞘氨醇桿菌屬占2.84%，金黃桿菌屬（Chryseobacterium）占2.33%。301種子附生細菌群落中，泛菌屬占52.58%，假單胞菌屬占24.25%，腸桿菌屬占2.88%，寡養單胞菌屬占1.05%。云煙85假單胞菌屬占30.59%，泛菌屬占13.57%，腸桿菌屬占11.40%，鞘氨醇桿菌屬占7.22%，根瘤菌屬占3.93%，寡養單胞菌屬占2.85%，微桿菌屬占1.43%，蒼白桿菌屬占1.40%，無色桿菌屬（Achromobacter）占3.01%，藤黃單胞菌屬（Luteimnas）占1.51%，Falsirhodobacter占1.50%，葡萄球菌屬Staphylococcus占1.33%，甲基桿菌屬（Methylobacterium）占1.87%，新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）占1.07%。此外，在4 個煙草品種種子樣品中還檢測到一些低豐度的細菌，如馬賽菌（Massilia）、Ralstonia和Cellvibrio等。

圖4 4個品種煙草種子附生細菌在屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundances of adnsacent bacteria on seeds of four tobacco cultivars at genus level

2.2.4 種子附生細菌比較

基于Bray-Curtis距離算法對煙草種子附生細菌群落進行主坐標（PCoA）分析，結果（圖5）表明，在OTU水平，品種K326和云煙85的樣品聚在一起，而品種L8和301種子樣品離其較遠，且品種K326和云煙85種子附生細菌群落結構最為相似。PC1和PC2的貢獻率分別為57.04%和22.53%，PC1 的貢獻率明顯大于PC2。表明PC1是影響煙草種子附生細菌群落結構差異的主要因素，PC1 的影響與K326、云煙85和L8種子附生細菌數量成正比，與301成反比，在PC1 的作用下，301 種子樣品斑點遠離其他種子，形成差異；PC2的影響與K326、云煙85和301種子附生細菌數量成正比，與L8成反比，在PC2的作用下，L8種子附生細菌樣品斑點遠離其他種子，也形成差異。

圖5 OTU水平煙草種子附生細菌主成分分析Fig.5 Principal component analysis of adnsacent bacteria on tobacco seeds at OTU level

在屬水平，對4個品種種子樣品附生細菌按豐度進行排序，選取排名前30 的細菌繪制豐度熱圖（圖6）。聚類熱圖結果表明，每個品種種子的3個樣品單獨聚為一支，說明樣品重復性好，品種K326 與云煙85種子樣品聚為一個分支，表明品種K326和云煙85種子的附生細菌群落最為相似，與主坐標分析結果一致。聚類樹分析表明，假單胞屬、泛菌屬和在屬水平未分類的腸桿菌科細菌聚為一支，腸桿菌屬、鞘酯假單胞菌屬、寡養單胞菌屬和根瘤菌屬聚為一支。各品種種子上，假單胞屬、泛菌屬的細菌最多，其次為腸桿菌屬、鞘酯假單胞菌屬、寡養單胞菌屬和根瘤菌屬細菌。

圖6 屬水平下4個品種煙草種子附生細菌的相對豐度Fig.6 Relative abundances of adnsacent bacteria on seeds of four tobacco cultivars at genus level

3 討論

本試驗中高通量測序發現，12 個樣品的覆蓋度指數均達到99.9%，且在測序序列數量內，稀釋曲線完全達到飽和，表明測序結果足以反映所研究的煙草種子附生細菌群落生物信息。同時，相對豐度熱圖上方的聚類樹和PCoA 的結果均發現每個品種的3個樣品間差異較小，表明本試驗中的取樣排除了較大的偶然性誤差。

高通量測序結果顯示4 個煙草品種種子附生細菌均分布于變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，其中含量最高的均為變形菌門。與3個煙草品種（K326、云煙85、云煙87）種子內生細菌在門水平上的優勢種群結果一致［7］。在屬水平上，4個品種豐度排名前10的附生細菌均分別是假單胞屬、泛菌屬、鞘氨醇桿菌屬、腸桿菌屬、糖芽胞桿菌屬、寡養單胞菌屬、根瘤菌屬、蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、微桿菌屬和金黃桿菌屬。相比而言，煙草種子內生細菌的優勢菌屬為假單胞菌屬、大腸桿菌—志賀菌屬、細桿菌屬、Lelliottia、鞘脂桿菌屬、糖芽胞桿菌屬、白色桿菌屬、寡養單胞菌屬等［7］。煙草種子附生細菌與內生細菌在群落結構上存在較大差異，但也存在共有優勢的菌屬假單胞屬、糖芽胞桿菌屬、寡養單胞菌屬等細菌，表明這些細菌為煙草種子內、外共生細菌；同時也發現種子優勢細菌泛菌屬為非種子內生菌。此外，本研究中還發現在種子附生細菌多樣性方面，烤煙云煙85和K326均高于雪茄煙301和白肋煙L8，這可能與煙草種子的種植環境、來源、采收季節不同等有關，同時也可能是由于煙草品種不同引起的差異，均有待通過同地、同季、同環境的比較試驗進一步驗證。

本試驗中發現煙草種子可培養附生細菌有假單胞菌屬、腸桿菌屬、鞘酯假單胞菌屬、寡養假單胞菌屬、泛菌屬、新鞘酯假單胞菌屬、歐文氏菌屬、短小桿菌屬、芽胞桿菌屬、金黃桿菌屬和農桿菌屬，其豐度較高細菌種類與高通量測序結果基本一致，說明傳統分離法也能反映種子優勢種群的群落結構和相對豐度。假單胞菌屬為煙草種子附生和內生細菌中種群豐度均最高的細菌類群，已有的研究發現，由丁香假單胞煙草致病變種（Pseudomonas syringaepv.tabaci）引起的煙草野火?。?5］和丁香假單胞桿菌角斑專化型（Pseudomonas syringaepv.angula）引起的煙草細菌性角斑?。?6］為煙草上兩種主要的細菌性病害，本試驗中檢測到的假單胞菌屬細菌中是否含有這兩種致病菌，仍有待進一步通過致病力檢驗來明確種子攜帶煙草致病菌的風險。此外，對于煙草種子的其他附生細菌，有研究發現泛菌屬中的菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）和分散泛菌（Pantoea dispersa）均會引起水稻葉枯?。?7］，成 團泛菌（Pantoea agglomerans）會引起紅棗壞死［18］；腸桿菌屬中的陰溝桿菌（Enterobacter cloacae）會引起洋蔥球和生姜根莖的軟腐?。?9-20］，桑腸桿菌（Enterobacter mori）會引起桃類果實的采前軟腐病［21］；類芽胞桿菌屬中的多黏類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）會引起火龍果的細菌性莖腐?。?2］。本試驗中檢測到的煙草種子附生細菌中是否也存在這些菌屬的煙草致病菌還有待通過致病力試驗進行驗證。

4 結論

①6 個煙草品種種子上共培養分離鑒定出細菌35株，其中假單胞菌屬9株，芽胞桿菌屬7株，腸桿菌屬6株，泛菌屬4株，鞘氨醇單胞菌屬2株，農桿菌屬2 株，新鞘酯桿菌、寡養單胞菌、歐文氏菌、短小桿菌和金黃桿菌屬各1株。②K326、白肋煙L8和云煙85種子的附生細菌組成和豐度相似，多樣性排序依次為云煙85＞K326＞L8＞301，雪茄煙301種子附生細菌在豐度上低于其他品種；4個煙草品種種子附生細菌共有的優勢菌屬有假單胞屬、泛菌屬、鞘氨醇桿菌屬、腸桿菌屬、糖芽胞桿菌屬、寡養單胞菌屬和根瘤菌屬等。