分散固相萃取高效液相色譜法測定蔬菜中滅蠅胺殘留

劉 蘭，周培華，湯春甫，康紹英，周興旺，袁列江

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410017）

滅蠅胺又名環(huán)丙氨嗪，是一種高效、低毒的生態(tài)農(nóng)藥，對雙翅目昆蟲有非常強的選擇性。該藥具有觸殺和胃毒作用，內(nèi)吸傳導(dǎo)性強、持效期長，但作用速度較慢。目前GB 2763—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量 規(guī)定：豆角、芹菜、黃瓜和杧果中滅蠅胺最大殘留限量值分別為0.5、4、1 mg/kg，人體每日允許攝入量為0.06 mg/kg bw（體重）。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)資料報道的滅蠅胺測定方法有高效液相色譜法[1-4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]。這些方法多數(shù)采用強陽離子萃取柱或者是氨基固相萃取柱進(jìn)行萃取，前處理耗時較長，且操作步驟多，易造成滅蠅胺的損失，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差較大。加上滅蠅胺有別于其他酸性或中性農(nóng)藥，它是一種堿性藥劑，不適宜采用多成分的農(nóng)殘檢測方法進(jìn)行檢測。筆者研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采取恒定比例的流動相進(jìn)行高效液相色譜檢測時，進(jìn)樣3～5 次以后就會有雜質(zhì)殘留在色譜柱內(nèi)，干擾檢測，而且高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定滅蠅胺時結(jié)果受基質(zhì)效應(yīng)影響較大[8]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769—2008 水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 中也注明該方法僅為定性測定，而且質(zhì)譜檢測的儀器在市縣級基層的應(yīng)用并不普遍。滅蠅胺作為一種低毒農(nóng)藥，主要用于防治蔬菜類的美洲斑潛蠅和潛葉蠅等農(nóng)業(yè)害蟲[2]，最大殘留限量值較高，高效液相色譜法完全可以滿足滅蠅胺的定性定量準(zhǔn)確測定。

分散固相萃取是一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘檢測前處理方法，相對其他前處理方法具有一定的優(yōu)勢[10-11]。分散萃取劑乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）去除脂肪酸成分的效果較好，而十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化炭黑（GCB）去除色素和維生素成分的能力較好，可以明顯改善凈化效果[12]。為了快速、簡便、準(zhǔn)確測定蔬菜中的滅蠅胺含量，筆者采用乙酸銨乙腈提取、分散固相萃取技術(shù)從改變流動相的配比及洗脫方式等方面優(yōu)化了蔬菜中滅蠅胺的高效液相色譜檢測方法，改良后的方法更加適用于蔬菜中滅蠅胺的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑有滅蠅胺（濃度100 μg/mL，安譜公司），乙腈（色譜純，德國CNW Technologies），乙酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。主要儀器有Agilent 1260 高效液相色譜（美國安捷倫）、Auto HG-24 全自動勻質(zhì)機(jī)（深圳市新悅科技發(fā)展有限公司）、旋渦混合器（常州潤華電器有限公司）、CM-1000 高速震蕩器（東京理化器械株式會社）、Milli-Q超純水器（德國Millipore）、EPPENDORF 5804R 臺式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德）、GM300 樣品研磨儀（德國萊馳）。凈化材料為乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）（Agela Technologies 公司）和0.45 μm 尼龍濾膜（天津市富成達(dá)科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件優(yōu)化（1）最佳檢測波長：選擇200～400 nm 波長范圍進(jìn)行掃描，從掃描目標(biāo)峰頂點提取光譜圖，以確定最佳檢測波長。（2）洗脫方式：以乙腈∶水為流動相進(jìn)行洗脫，設(shè)計恒定洗脫（乙腈∶水=97 ∶3）和梯度洗脫2 種方式，考察不同洗脫方式對檢測結(jié)果的影響。（3）其他色譜條件。檢測器：二極管陣列檢測器；色譜柱：Athena NH2-RP（4.6 mm×250 mm，5 μm，德國CNW Technologies 公司）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 滅蠅胺對照品溶液1.00 mL 到10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容到刻度，搖勻，得到10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃保存；分別精密量取適量的上述儲備液，用乙腈配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以色譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y）、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理優(yōu)化參照文獻(xiàn)[1]和農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)檢測方法NY/T 1725—2009、GB 23200.110—2018 和GB 23200.113—2018 的樣品前處理方式制定該研究的樣品前處理方法。具體步驟為：分別取經(jīng)過組織搗碎機(jī)處理的豆角、芹菜和黃瓜樣品各10 g（精確到0.01 g），加入10 mL 提取液（0.05 mol/L 乙酸銨與乙腈按體積比1 ∶4 混合制成）渦旋混勻提取10 min；加入1.0 g 無水硫酸鎂，再震蕩提取30 min，8 000 r/min離心3 min；準(zhǔn)確吸取4.0 mL 上層有機(jī)相到10 mL 離心管，加入1.0 mL 乙腈，混勻；加入適量PSA 和C18 進(jìn)行分散固相萃取，渦旋混勻凈化1 min，10 000 r/min 離心5 min；直接吸取上清液約2 mL 過0.45 μm濾膜，濾液裝于進(jìn)樣小瓶，待測。試驗分別考察了PSA 和C18 的不同添加量（PSA 添加量為50、100、150、200、250 mg；C18 添 加 量 為15、30、45、60、75 mg）對萃取效果的影響。

1.2.4 方法驗證和比較以未檢出滅蠅胺的樣品為空白基質(zhì)，分別向空白基質(zhì)中添加低、中、高不同含量水平的滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品，再使用PSA、C18 分散固相萃取法提取，分別采用分散固相萃取高效液相色譜法和NY/T 1725—2009 標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定，通過加標(biāo)回收試驗測定優(yōu)化后方法的加標(biāo)回收率和精密度，平行測定6 次，并比較2 種方法的優(yōu)缺點。

1.2.5 實際樣品檢測對市場隨機(jī)選取的豆角、芹菜和黃瓜各12 批次樣品使用分散固相萃取高效液相色譜法進(jìn)行滅蠅胺農(nóng)藥殘留量測定。按公式（1）計算樣品中滅蠅胺的含量。

式中，W為樣品中滅蠅胺的含量（mg/kg）；C為測得樣品的濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；80%為提取液有機(jī)相含量；V1為提取液稀釋前體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

選擇200～400 nm 范圍的波長進(jìn)行掃描，從掃描目標(biāo)峰頂點提取的光譜圖（圖1）顯示，滅蠅胺在215 nm 處具有最大吸收峰，因此將檢測波長定為215 nm 對滅蠅胺進(jìn)行定性鑒別及定量分析。NY/T 1725—2009 標(biāo)準(zhǔn)方法中高效液相色譜分析的流動相為恒定比例的乙腈水溶液（乙腈∶水=97 ∶3），從分離的效果和連續(xù)進(jìn)樣對后續(xù)檢驗的干擾來看，這種洗脫方式不適合連續(xù)進(jìn)樣，幾次進(jìn)樣后，殘留雜質(zhì)峰會干擾后續(xù)進(jìn)樣的目標(biāo)峰，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性以及后續(xù)樣品的分析。

圖1 滅蠅胺對照品及加標(biāo)樣品溶液目標(biāo)峰最大吸收光譜圖

通過多次摸索試驗，優(yōu)化了流動相的流速和配比，最終確定流動相配比及洗脫時間如表1 所示。當(dāng)流動相以梯度洗脫方式進(jìn)行檢測時，可以連續(xù)批量進(jìn)樣，前后連續(xù)相鄰樣品之間的分析沒有相互干擾，滅蠅胺的保留時間為9.520 min（圖2），且在滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品出峰前后沒有其他色譜峰干擾，基線平穩(wěn)，噪音較小，多次進(jìn)樣后，系統(tǒng)無污染，無雜質(zhì)峰干擾等情況發(fā)生。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖2 空白樣品（A）和滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品（B）的液相色譜圖

2.2 分散固相萃取凈化條件的確定

由圖3 可知，隨著PSA 劑量的增加，目標(biāo)物的回收率逐漸升高，而隨著C18 劑量的增加，目標(biāo)物的回收率降低，于是最終確定PSA 的添加量為200 mg、C18 的添加量為15 mg，混合后對樣品進(jìn)行分散固相萃取，其中色素較深的芹菜提取液在加入PSA、C18后，再加入了50 mg 的GCB 作為凈化劑。采用優(yōu)化后的前處理方法處理樣品，其中黃瓜樣品提取凈化液和加標(biāo)回收液的液相色譜圖如圖4 所示。

圖3 分散固相萃取劑不同添加量的回收率

圖4 黃瓜樣品提取凈化液（A）和加標(biāo)回收液（B）的液相色譜圖

2.3 線性范圍、回歸方程、檢出限及定量限

由標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）可知，該方法的線性范圍為0.05～1.0 μg/mL，回歸方程為y=109.408 9x-0.560 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。以空白樣品出峰時信號比S/N=3計算方法的檢出限，滅蠅胺的檢出限為0.02 mg/kg；以空白樣品出峰時信號比S/N=10 計算方法的定量限，定量限為0.05 mg/kg。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 加標(biāo)回收率和精密性

由表2 可知，分散固相萃取高效液相色譜法的平均回收率為96.3%～103.0%，RSD 為0.96%～5.02%；標(biāo)準(zhǔn)方法的平均回收率為98.3%～109.7%，RSD 為0.95%～3.87%。

表2 分散固相萃取高效液相色譜法同標(biāo)準(zhǔn)方法比較3 種蔬菜中加標(biāo)回收測定結(jié)果（n=6）

2.5 方法比較

以10 批次樣品的檢測為例，從結(jié)果的準(zhǔn)確性、前處理的時間、色譜柱的重復(fù)進(jìn)樣需要維護(hù)沖洗的次數(shù)等方面對標(biāo)準(zhǔn)方法和分散固相萃取高效液相色譜法進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表3 所示。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，分散固相萃取高效液相色譜法改進(jìn)的地方主要有：（1）前處理方法由固相萃取改為分散固相萃取凈化的方法，減少了固相萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的步驟和時間；（2）高效液相色譜方法流動相配比由恒比例改成了梯度洗脫，減少了色譜柱雜質(zhì)殘留的影響，不需要反復(fù)沖洗色譜柱，可以無限連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣；（3）定量更準(zhǔn)確，由標(biāo)準(zhǔn)方法的單點標(biāo)樣定量變成標(biāo)曲定量。綜合來看，改進(jìn)后的分散固相萃取高效液相色譜法在測定蔬菜樣品中滅蠅胺殘留時具有非常明顯的應(yīng)用優(yōu)勢。

表3 2 種方法的比較分析

2.6 實際樣品測定

如表4 所示，豆角中滅蠅胺的檢出率較高，存在一定的不合格批次，可能是因為在種植過程中豆角易發(fā)生病蟲害，防治藥劑使用較廣泛所致；在芹菜和黃瓜中滅蠅胺檢出批次較少，且沒有發(fā)現(xiàn)不合格批次，可能是因為芹菜和黃瓜種植過程中滅蠅胺使用較少。

表4 3 種蔬菜中滅蠅胺的測定結(jié)果

3 結(jié) 論

該研究建立了一種高效、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量的蔬菜中滅蠅胺農(nóng)藥殘留量的分散固相萃取高效液相色譜測定方法。該方法的檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，結(jié)合樣品的限量值，改良后的方法完全可以滿足國內(nèi)外大、中、小城市蔬菜樣品中滅蠅胺農(nóng)藥殘留量的檢測。前處理方法由繁瑣耗時的固相萃取加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮改良為高效簡便的分散固相萃取方法；且改變了流動相的配比和洗脫方式，不需要反復(fù)沖洗維護(hù)色譜柱，使測定變得連續(xù)且具有可重復(fù)性；定量更加準(zhǔn)確，由標(biāo)準(zhǔn)方法的單點標(biāo)樣定量變成了標(biāo)曲定量。改進(jìn)后的方法具有非常明顯的實際應(yīng)用優(yōu)勢，解決了食品檢測行業(yè)滅蠅胺準(zhǔn)確測定這一難題。在以后的研究中，可根據(jù)技術(shù)的進(jìn)步加強相關(guān)食品檢測標(biāo)準(zhǔn)的更新，同時注意加強方法適應(yīng)范圍的擴(kuò)大。通過準(zhǔn)確檢測可以督促以滅蠅胺為防治藥劑的種植戶在蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品種植過程中更加規(guī)范地使用化學(xué)藥劑，保證蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品度過農(nóng)藥間隔期再上市，提高種植者的社會責(zé)任意識，減少滅蠅胺農(nóng)藥的濫用。