斑節對蝦(非洲群體)腸道中哈維氏弧菌拮抗菌的篩選、鑒定及生理特性分析

劉吉丹 樊 英 劉洪軍 唐學璽 王曉璐 王友紅 葉海斌 蓋春蕾

(1.中國海洋大學海洋生命學院, 青島 266100; 2.山東省海洋科學研究院(青島國家海洋科學研究中心),山東省海水養殖病害防治重點實驗室, 青島 266104)

斑節對蝦(非洲群體)(Penaeus monodon)俗稱金剛蝦、斑節王, 隸屬節肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對蝦科(Penaeidae)對蝦屬(Penaeus), 是蝦類新興品種[1]。因其生長速度快、抗逆性強、蝦池無須改造即可轉養等優點被引進我國, 近年來養殖規模不斷擴大, 養殖范圍逐漸從東南沿海向北方延伸[2]。然而, 多種弧菌引起的急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)對生產養殖造成巨大損失, 其中哈維氏弧菌是主要病原之一。

細菌間的拮抗作用可以被用來抑制病原菌的生長, 這是進行生物防治的有效途徑[3]。目前對病原菌的拮抗性仍作為益生菌篩選的主流標準[4]。從動物體內或體表可分離得到益生效果優良的土著菌, 本實驗通過對健康斑節對蝦腸道菌群進行篩選,得到優勢菌株, 并對其進行深入研究。

本實驗通過牛津杯法, 篩選得到AHPND哈維氏弧菌的拮抗菌(P.m-1、P.m-9和P.m-13), 采用多種方法對菌株進行鑒定, 得出其菌株具體信息后,對其進行藥敏實驗, 以檢驗菌株安全性, 從而得到對藥物高度敏感的拮抗菌株。為檢驗其生命力, 我們還對其進行了生長特性實驗。根據體外酶活性測定結果, 我們初步推斷產酶能力可能有助于其抑菌效果的發揮。本實驗旨在從腸道微生態角度研發功能性飼料添加劑, 為斑節對蝦工廠化健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株本實驗室從山東濱州和東營某養殖基地的斑節對蝦樣品中分離得到的 14株斑節對蝦腸道優勢菌(編號: P.m-1、P.m-2······P.m-14),養殖期間投喂量為體重的 8%—10%, 每天分4次投喂(6:00, 11:00, 17:00和22:00), 周期長約56d。全程曝氣, 水溫28—29℃, 鹽度35—36, pH 8.0—8.6, 溶氧量≥7.5 mg/L, 總氨氮≤0.25 mg/L。每天上午9:00—10:00換水, 日換水量達總體積的30%。哈維氏弧菌從AHPND患病蝦池中分離獲得, 為本實驗室保藏菌株。

培養基TSA培養基、2216E培養基、MRS培養基、TCBS培養基和Biolog培養基均購自青島海博生物技術有限公司。

試劑斑節對蝦配合飼料, 購自江門市特種水產飼料有限公司; HBIG14芽孢桿菌生化鑒定條和HBIG11乳酸菌生化鑒定條均購自青島海博生物技術有限公司; 抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。乙酰甲喹和萘啶酮酸購自上海源葉生物科技有限公司; 阿奇霉素、磺胺嘧啶、卡那霉素和氟苯尼考均購自北京索萊寶科技有限公司;TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0購自寶日醫生物技術(北京)有限公司; DNA marker和TaqDNA聚合酶購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

優勢菌的分離和純化無菌條件下取對蝦的全腸于離心管中, 在冰浴條件下研磨勻漿。使用1% PBS溶液對研磨液進行10倍梯度稀釋直至稀釋倍數為10–5; 取各濃度梯度菌液(包括原液)各100 μL涂布于2216E固體培養基上, 每個梯度3個平行,28℃恒溫培養箱中倒置培養24—48h。挑取形態和顏色不相同的單菌落進行多次劃線純化, 確定為純培養物后進行保種。

拮抗菌的篩選采用牛津杯法對腸道優勢菌進行篩選, 以哈維氏弧菌為指示菌。用移液器準確吸取0.1 mL哈維氏弧菌(108cfu/mL)于2216E培養基上, 用玻璃涂布棒涂布均勻, 然后用鑷子將牛津杯置于培養基中央, 輕壓使其不易移動, 杯中分別加入0.2 mL優勢菌懸液(108cfu/mL)。將所有平板正置放入培養箱中28℃下培養48h, 進行抑菌圈直徑的測定, 游標卡尺測量3次取平均值。

拮抗菌的菌株鑒定: 生理生化鑒定使用成套生化鑒定試劑條按照相應說明書進行鑒定, 接種結束后做好標記。具體接種方法如下: 挑取菌落接種于營養瓊脂斜面或平板。若試劑條中內容物為液體, 采用菌懸液法接種; 若內容物為固態, 則采用“之”字形劃線接種或穿刺接種。測定項目包括: 硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P、七葉苷水解和精氨酸雙水解酶等, 具體生化試驗參照國家標準依據菌株而定。放置于(36±1)℃條件下進行培養, 厭氧生長生化管放入厭氧環境中進行培養。在培養結束后,對比記錄卡觀察結果。參照伯杰氏細菌鑒定手冊(第九版)和國家標準確定其分類地位。

16S rDNA技術及系統發育分析在多次劃線純化后, 挑取平板單菌落, 通過16S rDNA 序列分析技術鑒定菌株。使用試劑盒法提取菌株的基因組DNA。所用引物為 27F (5'-AGTTTGATCMTGG CTCAG-3')和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3'), 通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增提取DNA, 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化后的PCR產物, 送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序, 應用BLAST軟件將所得序列在GenBank的資源庫中進行同源性分析。選取相應菌屬及相似屬的11株細菌的16S rDNA序列, 利用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

Biolog系統鑒定及表型代謝分析按照接種培養流程進行操作。將純化后的單菌落接種于Biolog瓊脂平板劃“十”字培養16—24h, 用接種棒挑取“十”字四邊外半部分的菌落, 在IF-A接種液中分散制備菌懸液, 調整透光率為95%—98%, 靜置5min后傾入“V”型貯液槽中, 用八道孔移液器每孔加100 μL菌懸液于GEN Ⅲ板條中, 置于30℃培養箱中孵育, 經Biolog自動微生物鑒定系統讀取菌株基本信息(48h)和指紋代謝圖譜(72h)。

腸道菌的耐藥性分析將2216E固體培養基滅菌后冷卻至50℃左右, 按照0.5%的比例[5]分別加入阿奇霉素、磺胺嘧啶和卡那霉素等13種抗生素,充分混勻后倒平板。取200 μL腸道優勢菌涂布含藥平板, 28℃培養48h后觀察并記錄腸道菌的生長結果。挑取含抗藥平板上形態不一致的菌株純化3—4次, 利用16S rDNA技術鑒定, 得到耐藥菌的基本信息。

藥敏紙片實驗(紙片擴散法)按1%的比例將菌株接種于2216E液體培養基中, 28℃振蕩培養(135 r/min)18h備用。采用紙片瓊脂擴散法進行耐藥性分析: 在超凈工作臺內, 取腸道優勢菌液200 μL,均勻涂布TSA培養基, 將藥敏紙片均勻貼布于培養基表面(每個平板貼布3—4片), 輕輕按壓以防止移動。28℃培養48h后, 測定抗生素的抑菌圈直徑。依據透明圈直徑判定藥物敏感性。

生長曲線的繪制將P.m-1接種于TSB液體培養基中, 30℃下135 r/min振蕩培養18h制成種子液。將P.m-1按1%的比例接種新鮮TSB培養基, 在96孔板中每孔加入250 μL 種子液。以空白TSB培養基為對照, 每次加樣設置6個復孔。打開酶標儀系統, 放置96孔板, 選中掃描區域, 設置培養溫度30℃, 測定波長600 nm。酶標儀自動振搖, 每隔2h讀取OD600, 培養72h后結束實驗。計算每個時間點的OD600平均值, 以培養時間為橫坐標, 以OD600為縱坐標, 繪制待測菌株的生長曲線。

蛋白酶活性的測定將P.m-1的發酵液(種子液)離心(6000 r/min, 10min), 分離上清液即為粗酶液。胞外蛋白酶活性采用Folin-酚法測定: 在pH為7.8的條件下, 粗酶液28℃水解酪蛋白10min, 1min產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位(U)。

2 結果

2.1 優勢菌的篩選結果

從健康斑節對蝦腸道內分離純化得到的細菌中, 挑選其中不同形態和顏色的14株優勢菌株進行實驗, 表1和圖1展示具有代表性的優勢菌的形態特征及革蘭氏染色結果。

圖1 革蘭氏染色結果Fig.1 Gram staining diagram results

表1 優勢菌的形態特征及革蘭氏染色結果Tab.1 Morphological characteristics and Gram staining results of dominant strains

2.2 拮抗菌的篩選結果

以哈維氏弧菌為病原菌, 從14株優勢菌中篩選拮抗菌, P.m-1、P.m-9和P.m-13的抑菌效果表現為“+++”(圖2和表2), 說明哈維氏弧菌對菌株P.m-1、P.m-9和P.m-13極敏感。本實驗的拮抗標準[6]為: 抑菌圈直徑>20 mm, 對于弧菌的抑制效果為極敏感“+++”; 15<抑菌圈直徑<20 mm, 抑菌效果為高敏“++”; 10<抑菌圈直徑<15 mm, 抑菌效果為中敏“+”;抑菌圈直徑<10 mm, 則抑菌效果為低敏或無效“–”。P.m-1、P.m-9和P.m-13具有明顯的哈維氏弧菌抑制作用。抑菌效果是益生菌篩選的主要標準, 所以后續研究圍繞P.m-1、P.m-9和P.m-13開展。

表2 優勢菌P.m-1、P.m-9和P.m-13對病原菌的抑制作用Tab.2 Inhibtory activity of P.m-1, P.m-9 and P.m-13 to pathogen

圖2 優勢菌P.m-1、P.m-9和P.m-13對病原菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory activity of P.m-1, P.m-9 and P.m-13 to pathogen

2.3 拮抗菌的鑒定

生理生化結果根據生理生化實驗結果(表3),參照伯杰手冊和國家標準GB 4789.35-2016, P.m-1被鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis), P.m-9被鑒定為乳酸菌屬, P.m-13被鑒定為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。

表3 P.m-1、P.m-9和P.m-13的生化鑒定結果Tab.3 Biochemical identification of P.m-1, P.m-9 and P.m-13

16S rDNA基因序列分析送測的16S rDNA基因序列, 提交到GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 進行Blast序列比對。結果表明P.m-1與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似性最高, 達100.00%; P.m-9與屎腸球菌(Enterococcus faecium)同源性最高, 達100.00%; P.m-13與溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)同源性最高, 達100.00%。選取相應菌屬及相似屬的11株細菌的16S rDNA序列, 利用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。發育樹(圖3)的結果表明, P.m-1與枯草芽孢桿菌親緣關系最近, P.m-9與屎腸球菌親緣關系最近, P.m-13與溶藻弧菌親緣關系最近。

圖3 基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

Biolog系統鑒定結果Biolog系統讀取GENⅢ板并給出4個匹配度最高的細菌種類(表4)。鑒定結果包括3個參數, 可能性(PROB)表示可能性大小, 相似性(SIM)和位距(DIST)表示準確性和精確度。48h的培養結果表明, P.m-1、P.m-9和P.m-13為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、海氏腸球菌(Enterococcus hirae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),鑒定概率分別為95.3%、71.1%和89.7%。

表4 P.m-1和P.m-9的Biolog鑒定結果Tab.4 Identification of intestinal bacteria P.m-1 and P.m-9 (Biolog method)

根據16S rDNA技術、Biolog系統鑒定及生理生化實驗結果, 最終確定P.m-1、P.m-9和P.m-13分別為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和溶藻弧菌(Vibrio alg inolyticus)。

2.4 藥敏實驗結果

腸道菌的耐藥性分析在含藥平板上生長的單菌落(圖4)經純化后送測, BLAST比對后得到斑節對蝦腸道菌基本的耐藥情況(表5)。實驗結果表明, P.m-1、P.m-9和P.m-13均不屬于腸道耐藥菌。

表5 腸道耐藥菌測序結果、菌株名稱及登錄號Tab.5 Sequencing results, name and Genbank accession of intestinal drug-resistant bacteria

圖4 腸道菌在含藥平板的生長狀況Fig.4 The growth of intestinal bacteria on the plate containing antibiotic

藥敏紙片實驗結果根據NCCLS的最新判斷標準, P.m-1對青霉素、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定和呋喃唑酮具有耐藥性(R), 對氨芐西林、頭孢他啶、四環素和克林霉素中度敏感(I), 對其他抗生素均表現為敏感(S); P.m-9表現出對諾氟沙星敏感(S), 對慶大霉素和麥迪霉素中度敏感(I), 對其他抗生素均具有耐藥性(R); P.m-13對卡那霉素、新霉素、四環素、多西環素和多黏霉素B敏感(S), 對頭孢他啶、丁胺卡那和萬古霉素中度敏感(I), 對其他抗生素均耐藥(R)(表6)。耐藥菌株給生產帶來損失的同時對人體健康有害, 因此選取對藥敏性高的P.m-1進行后續的生長特性實驗。

表6 P.m-1、P.m-9和P.m-13的藥敏實驗結果Tab.6 The antibiotic susceptibility of P.m-1, P.m-9 and P.m-13

2.5 P.m-1的生長曲線

在P.m-1的生長過程中, 0—2h是生長緩滯期,2—10h為生長對數期, 10—22h 為平臺期, 22h步入衰亡期。2—10h, P.m-1的生命力最強, 生長速率最大, 代謝活性最旺盛。而后由于營養物質消耗及有害代謝產物積累, 細胞衰老甚至出現自溶現象, 培養22h后菌體的密度明顯下降(圖5)。在培養過程中, 10h的懸液OD600值最高, 菌體密度可達1.14×109cfu/mL, 表明P.m-1生命力強勁。

圖5 P.m-1的生長曲線(TSB培養基)Fig.5 The growth curve of P.m-1 in TSB

2.6 Biolog代謝特征分析

Biolog細菌全自動鑒定系統的GEN Ⅲ微孔板中含有不同的底物, 培養過程中發生氧化還原反應和同化反應, 比對Gen Ⅲ微孔板底物及鑒定特征項目, 可以得到細菌代謝特征的“指紋圖譜”。P.m-1代謝的底物種類有18種, 主要包括糊精、D-麥芽糖等; 同化底物種類主要包括D-山梨醇、D-甘露醇等(圖6)。此外, Biolog結果還提示P.m-1具有消化能力, 如氨基酸代謝。

圖6 P.m-1在鑒定板上的代謝指紋圖譜Fig.6 Metabolic fingerprint of P.m-1 on identification board

2.7 產酶能力評價

經Biolog指紋代謝圖譜提示, 測定P.m-1發酵上清液的蛋白酶活性。本實驗測得發酵上清液的OD值為0.14, 根據標準曲線(圖7)并結合稀釋倍數計算得到枯草芽孢桿菌P.m-1的胞外蛋白酶活性可達259 U。由此得出枯草芽孢桿菌P.m-1具有較強蛋白消化能力, 可能為其生長提供條件。

圖7 蛋白質濃度標準曲線Fig.7 Standard curve of protein concentration

3 討論

當前國內對蝦養殖業的問題頗多, 其中一大原因就是疾病威脅, AHPND就是其中的一種。目前許多研究和實踐已經證明, 可以動物體土著菌作為益生菌株, 以菌治菌, 解決斑節對蝦的疾病問題。本實驗從健康斑節對蝦腸道中篩選AHPND病原菌——哈維氏弧菌的拮抗菌株, 在經過耐藥性檢驗、生長特性分析和產酶效果評價后, 發現拮抗菌P.m-1具有良好益生菌潛質。后續將在實踐中試用此菌種,以評價其在疾病防控的效果。

3.1 對蝦益生菌的篩選與鑒定

對蝦屬于無脊椎甲殼類動物, 主要依賴非特異性免疫系統發揮功能。在水生動物體內, 腸道菌群具有調節作用, 其中的益生菌發揮益生機制, 抑制或殺滅外來病原菌, 進而維持腸道穩態。在宿主腸道內實現定植, 是益生菌發揮作用的首要條件。由于土著菌對腸原生態具有較好的適應性, 這往往使得定植作用更易實現。對病原菌具有抑制效果, 這是益生菌的功能性要求[7]。目前, 體外拮抗實驗仍作為抗病益生菌篩選的主流方法。本實驗牛津杯法篩選出對病原菌具有良好抑制效果的土著菌——P.m-1、P.m-9和P.m-13。

對篩選出的拮抗菌進行種屬鑒定, 是承上啟下的重要步驟[8]: 精確的分類地位不僅有利于明確菌種信息, 而且有利于了解研究進展和應用現狀。目前存在多種菌株的鑒定方法, 一般來說我們會綜合多種方法, 并輔以生理生化特征驗證。本實驗主要采取了3種方法, 以保證結果的準確性。其中, 16S rDNA 技術基于序列的進化保守性, 鑒定結果比較準確, 可作為菌株鑒定的主要方法[9]。經鑒定, P.m-1、P.m-9和P.m-13分別為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。

3.2 芽孢桿菌屬的益生潛質

本實驗中P.m-1具有弧菌拮抗活性, 我們可以充分利用其這一特性, 將P.m-1添加于養殖生產飼料, 進而有效防控對蝦AHPND。據報道芽孢桿菌屬具有多種益生作用, 例如Irasema等[10]曾從對蝦腸道中分離出4株非溶血性芽孢桿菌, 對創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、坎氏弧菌(Vibrio campbelli)、副溶血弧菌和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)均具有明顯的拮抗作用。 Lins等[11]發現枯草芽孢桿菌的添加有利于提升銀鯰(Rhamdia quelen)的生長性能;Cao等[12]研究發現補充枯草芽孢桿菌顯著改善了彭澤鯽(Carassius auratusvar.Pengze)腸道的褶皺高度和微絨毛高度; Xia等[13]的研究表明投喂枯草芽孢桿菌能夠顯著增加尼羅羅非魚腸道微絨毛密度、微絨毛長度以及周長比(腸腔內周長與腸外周長之比)。

Werasan等[14]從健康對蝦體內篩選到1株可以抑制多種AHPND致病副溶血弧菌的潛在益生菌——枯草芽孢桿菌AQAHBS001, 將其添加進飼料可顯著降低WSSV病毒的脅迫致死率, 改善微絨毛和腸壁厚度等中腸結構特征, 提高凡納濱對蝦的生長性能, 增強吞噬細胞活性并且提高病毒清除效率。Subuntith等[15]從斑節對蝦腸道和生長環境中分別分離出兩株芽孢桿菌, 通過凍干、微膠囊形式加入水中或者富集鹵蟲進行飼喂, 結果表明不同給藥方式均可顯著提升凡納濱對蝦早期發育過程的生長性能和存活率, 增加機體和養殖水體的有益細菌豐度, 并改善pH、氨氮和亞硝態氮含量等養殖水質指標。

3.3 潛在益生菌的安全性評價

糞腸球菌調節動物腸道菌群, 提高動物生長性能, 提高機體抗病能力。張棋等[16]報道屎腸球菌和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)具有拮抗病原菌作用和一定益生效果。溶藻弧菌當基因表達改變時,也可促進凡納濱對蝦幼體的生長, 提高幼蝦的成活率[17],增強水生動物的免疫力和抗病力[18]。本實驗通過對腸道菌進行耐藥性檢測, 發現P.m-1、P.m-9和P.m-13不在腸道耐藥菌之列。耐藥菌在水產養殖上并不可取, 因為其不僅會導致多種病害, 造成經濟損失; 而且通過抗生素抗性基因(ARGs)接合等方式, 產生健康影響。

抗生素耐藥性模型的建立是保障益生菌安全性的重要步驟[19]。藥敏紙片實驗(紙片擴散法)進一步表明, P.m-9和P.m-13對大多數抗生素都具有抗性, P.m-1的抗生素藥敏性較強, 因此P.m-9和P.m-13并不符合安全要求, 而P.m-1具有成為益生菌的潛質。枯草芽孢桿菌曾先后被美國食品藥物管理局(FDA)和中國農業農村部列為飼料添加安全菌株[20]。目前已作為益生菌制劑, 廣泛應用于人體及其他動物。而且P.m-1取自對蝦, 這也在一定程度上能夠保障其安全性[21]。

Yang等[22]對在淡水魚養殖中對解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)進行安全性評價, 通過評估其對草魚(Ctenopharyngodon idella)、銀鯽(Carassius gibelio)和鰱(Hypophthalmichthys molitrix)的混養池微生物群落的影響, 得出菌株具有高度安全性的結論。Muhamad等[23]從克氏原螯蝦腸道中分離出3株具有抑菌活性的潛在益生菌——枯草芽孢桿菌FS6、貝萊斯芽孢桿菌FS26和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)FS97, 根據抗生素敏感性分析和溶血活性實驗, 他們認為分離的芽孢桿菌屬具有一定安全性。Kim等[24]對31株凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)進行毒素基因、溶血活性和抗生素耐藥性檢測, 發現凝結芽孢桿菌具有一定的安全性。

3.4 益生菌篩選的其他要求

在滿足菌株安全性的前提下,益生菌能否快速生長繁殖, 也是發揮拮抗作用的關鍵[25]。腸道作為一個復雜的生態系統, 其中的微生物既互利共生又相互制約, 共同促進菌群平衡。一方面, 益生菌吸收營養物質, 有利于占據定殖位點, 形成和維持優勢地位; 另一方面, 通過分泌胞外產物, 競爭性排斥病原菌, 抑制條件致病菌的生長。本實驗P.m-1對數生長期末菌體密度可達1.14×109cfu/mL, 表明P.m-1生命力強勁, 滿足作為益生菌的生長速度需求。

胞外酶的產生種類和能力成為益生菌篩選的又一重要標準。王佰濤等[26]發現蠟樣芽孢桿菌W21-B5具有較強的產蛋白酶和產淀粉酶功能; 朱永明等[27]篩選得到最優抑制大腸桿菌的淀粉芽孢桿菌B-4M-6, 具有最佳產淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的能力。本實驗通過測定懸液中的消化酶活性,初步推斷所得的枯草芽孢桿菌P.m-1通過分泌蛋白酶發揮益生作用。據報道, 消化酶在動物體腸道保持一定的比例, 幫助宿主消化食物的同時, 還可以分解水中的殘餌雜質等[28]。

3.5 芽孢桿菌屬的作用機制

枯草芽孢桿菌DSM33018降解由質粒PirAVP和PirBVP基因編碼的AHPND毒素[29]。Riet等[30]對枯草芽孢桿菌進行基因編輯, 產生與WSSV vp28基因的互補dsRNA, 從而抑制WSSV病毒的復制活動。枯草芽孢桿菌E20能夠加強凡納濱對蝦對氨基酸的吸收, 通過谷氨酰胺代謝和己糖胺生物合成途徑(HBP)改善免疫機能[31]。枯草芽孢桿菌的表面活性素(Surfactin)通過ERK和PI3K/AKT通路抑制細胞周期進展并誘導細胞凋亡[32]。枯草芽孢桿菌通過宿主細胞膜轉運蛋白(OCTN2)介導的群體感應信號分子CSF(Sporulation factor), 激活AKT和p38 MAPK通路, 誘導熱休克蛋白的產生, 抑制腸道上皮細胞產生氧化損傷現象[33]。

此外, 目前針對其他芽孢桿菌屬的菌種學界也多有報道。解淀粉芽孢桿菌的多糖EPS-K4可以刺激機體分泌黏蛋白、減少血清中毒力物質含量[34],還可以用來維持腸道屏障完整性等。解淀粉芽孢桿菌CBSYD產生的抗氧化肽YD1具有強氧化活性,通過Nrf-2轉錄因子介導血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達發揮作用[35]。此外, 表面活性素還作為一種群體感應信號分子, 影響解淀粉芽孢桿菌碳代謝過程中的多項反應, 如糖酵解途徑和TCA循環等[36]。

本實驗P.m-1益生作用的發揮可能與其蛋白酶分泌能力有關, 具體的分子機制有待于通過實驗設計探明。芽孢桿菌屬除可用于增強動物的體質和防治疾病, 而且具有一定的緩解應激以及改善水質的作用。Zhao等[37]發現枯草芽孢桿菌產生的脂肽可以促進鉛離子(Pb2+)的富集和沉淀, 在此之前的實驗研究還證明過枯草芽孢桿菌產生的脂肽可以將銀離子(Ag+)還原為銀納米顆粒(AgNPs)[38]。張峰峰等[39]研究得到枯草芽孢桿菌可以有效降低水體pH, 劉曉燕等[40]還通過研究發現枯草芽孢桿菌能夠顯著降低水體氨氮含量、硝態氮含量及化學需氧量(COD值)。后續將嘗試本實驗獲得的潛在益生菌株用于水體, 檢驗其在水質調節方面的作用效果。