甜菜黃萎病菌生物學(xué)特性及16種殺菌劑的毒力比較

榮 華，張盧慧，劉 龍，鄭童童，雷 斌，郭慶元

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)林外來入侵有害生物監(jiān)測預(yù)警與綜合防控生點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】甜菜（Beta vulgarisL.）是新疆優(yōu)勢經(jīng)濟(jì)作物[1]。新疆是我國最大的甜菜生產(chǎn)區(qū)，甜菜制糖業(yè)占全疆輕工業(yè)產(chǎn)值的1/4以上[1]，也是我國北方最大甜菜糖制糖基地[2]。病害發(fā)生制約著甜菜生產(chǎn)[3]。2016年新疆部分甜菜種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新的甜菜病害甜菜黃萎病[4]，其病原為變黑輪枝菌（Gibellulopsis nigrescens），該病原菌可以在土壤中存活數(shù)年[5-6]，植株主要發(fā)病癥狀表現(xiàn)為葉片局部黃化，半葉黃化，或脈間黃化，直至萎蔫、枯死。研究該病害的生物學(xué)特性及抑菌藥劑，對(duì)該病害的防治有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Pethybridge[7]從馬鈴薯植株和塊莖中分離得到產(chǎn)生厚垣孢子的一種真菌，通過形態(tài)學(xué)分類方法將其歸屬于Plectosp Haerellaceae 科Verticillium屬，其命名為Verticillium nigrescens Pethybr；在近年有關(guān)分類研究中，又將該種劃歸Gibellulopsis屬，其種名變更為Gibellulopsis nigrescens。對(duì)甜菜黃萎病的發(fā)生也有不少報(bào)道，但迄今國內(nèi)對(duì)甜菜黃萎病的認(rèn)識(shí)一直是將其作為植原體病害來理解[8-9]，趙志強(qiáng)等[4]也在近年報(bào)道了新疆采集的甜菜黃萎病是由變黑輪枝菌引起的。有研究者將病原鑒定為變黑輪枝菌（Gibellulopsis nigrescens）[10]和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[11-12]。【本研究切入點(diǎn)】由變黑輪枝菌（Gibellulopsis nigrescens）引起的甜菜黃萎病是一種國內(nèi)新近發(fā)現(xiàn)的病害。目前，國內(nèi)有關(guān)這一新發(fā)現(xiàn)的由變黑輪枝菌引起的甜菜黃萎病的研究和報(bào)道甚少。需研究該病病原菌特性，促進(jìn)防治技術(shù)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用生長速率法，研究該病原菌營養(yǎng)特性、溫度適應(yīng)性、酸堿適應(yīng)性、光照適應(yīng)性等主要生物學(xué)特性，并針對(duì)該菌篩選出抑菌力較強(qiáng)的殺菌劑，為該病害防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

甜菜黃萎病病原菌（Gibellulopsis nigrescens）3個(gè)菌株BV3、BV4和BV5于2017年從新疆伊寧縣阿熱吾斯塘鄉(xiāng)的甜菜發(fā)病處分離獲得，保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理系作物病害研究室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、查式培養(yǎng)基（Czapek）[13]、改良查式2 號(hào)培養(yǎng)基（NO.2 Czapek）[14]、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、馬鈴薯培養(yǎng)基（PA）[15]。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL。

查式培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，加水1 000 mL。

改良查式2號(hào)培養(yǎng)基（NO.2 Czapek）：乳糖2 g，蛋白胨10 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂粉14 g，加水1 000 mL。

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母膏1 g，；磷酸二氫銨0.5 g，硫酸鎂1 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL。

1.1.3 供試藥劑及濃度

查閱黃萎病殺菌劑[16-17]相關(guān)文獻(xiàn)，選擇16種供試藥劑。表1

1.1.4 供試菌菌餅

將病原菌挑取在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28 ℃，14 d，使其在培養(yǎng)皿大面積長滿菌落后，用直徑6mm打孔器切取菌餅備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長量測定

分別于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、查式培養(yǎng)基（Czapek）、改良查式2 號(hào)培養(yǎng)基（NO.2 Czapek）、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、馬鈴薯培養(yǎng)基（PA）平板中央接種菌餅，每個(gè)菌株處理設(shè)3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 d 后采用十字交叉法[18]測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各菌株平均值。

1.2.2 病原菌在不同碳源培養(yǎng)基上生長量測定

以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別等量替換其中的碳源成分。供試碳源為葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖和木糖醇，分別在培養(yǎng)基中央接種菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)菌株處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各菌株平均值。

1.2.3 病原菌在不同氮源培養(yǎng)基上生長量測定

以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別等量替換其中的氮源成分。供試氮源為硫酸氨、亞硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨和磷酸二氫銨，分別在培養(yǎng)基中央接種菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)菌株處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各菌株平均值。

1.2.4 病原菌溫度適應(yīng)性

在PDA培養(yǎng)基平板中央接種菌餅，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)菌株處理設(shè)3 次重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各菌株平均值，分析其生長溫度和最適生長溫度。

將直徑為6 mm的菌塊置于加有2 mL無菌水的已滅菌的3 mL 容量的指形管中，分別置于45、50、55、60、65、70、75 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min，取出迅速冷卻；將菌塊置于PDA平板上。每個(gè)菌株處理設(shè)3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 d 后確定菌絲致死溫度范圍。在致死溫度范圍內(nèi)，以1 ℃為溫度梯度，重復(fù)試驗(yàn)，確定該病原菌致死溫度[19]。

1.2.5 病原菌光照適應(yīng)性調(diào)查

在PDA培養(yǎng)基平板中央接種菌餅，分別置于24 h 光照、12 h 光照和12 h 黑暗交替和24 h 黑暗下，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)菌株處理設(shè)3 次重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各菌株的平均值，分析不同光照對(duì)菌落生長的影響。

1.2.6 病原菌酸堿適應(yīng)性調(diào)查

用1 mol/L HCl 溶液和1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基的pH 值[20]分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，取15 mL 不同pH 值的培養(yǎng)基制備平板，在其中央接種菌餅，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)菌株處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑統(tǒng)計(jì)各菌株的平均值，分析不同酸堿條件對(duì)菌落生長的影響。

1.2.7 16種農(nóng)藥對(duì)病原菌的毒力測定

每一濃度藥液吸取1 mL加入到9 mL的PDA培養(yǎng)基中制成含藥平板，以無菌水為對(duì)照。在含藥平板中央接種菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每處理3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)14 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 26.0求得毒力回歸方程[21]、有效中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（R），根據(jù)EC50大小評(píng)價(jià)各殺菌劑的抑菌效果。

抑菌率=[（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑]×100%[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌營養(yǎng)特性

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

研究表明，病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長速率有顯著差異；不同菌株在同一種培養(yǎng)基上的生長速率也多有差異；所有菌株均在查氏培養(yǎng)基上生長速度最快，其次在馬鈴薯培養(yǎng)基、改良查氏2號(hào)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長較快，在水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上生長速率最小；所有菌株在營養(yǎng)充足時(shí)，菌落生長較快的查氏培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基（PA1）、改良查氏2號(hào)培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基上氣生菌絲生長濃密，相反在水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上則氣生菌絲較稀薄。圖1

圖1 不同培養(yǎng)基下菌落生長直徑變化Fig.1 Comparison of colony growth diameters under different Medium

2.1.2 碳源、氮源對(duì)菌絲生長的影響

研究表明，病原菌各菌株均可利用所有5種碳源營養(yǎng)，使菌落生長增大，但不同的碳源營養(yǎng)對(duì)菌絲生長的影響差異不大；3個(gè)供試菌株在含有乳糖的培養(yǎng)基上菌絲生長最快，在含葡萄糖的培養(yǎng)基上菌絲生長最慢。圖2

圖2 不同的碳源下菌落生長直徑變化Fig.2 Comparison of colony growth diameters under different carbon sources

病原菌各菌株均可利用所有5種氮源營養(yǎng)，使菌落生長增大，不同的氮源營養(yǎng)對(duì)菌絲生長的影響差異較大；供試菌株在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，在以磷酸二氫銨作為氮源的培養(yǎng)基上生長最慢。圖3

圖3 不同氮源下菌落生長直徑變化Fig.3 Comparison of colony growth diameters under different nitrogen sources

2.2 病原菌溫度適應(yīng)性

2.2.1 病原菌的生長溫度及最適生長溫度

研究表明，病原菌均可在5 ～35 ℃生長，在25 ～30 ℃時(shí)生長最快，且菌株之間差異不大。病原菌生長溫度在5 ～35 ℃，最適生長溫度為30 ℃。圖4

圖4 不同溫度下菌落生長直徑變化Fig.4 Comparison of colony growth diameters under different temperatures

2.2.2 病原菌的致死溫度

研究表明，甜菜黃萎病菌在45 ～75 ℃，5 ℃為梯度的測定中，各菌株經(jīng)45 ～55 ℃、10 min 恒溫水浴處理后，仍能在PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，在60 ℃以上，病原菌全部致死。56 ～59 ℃，1 ℃為梯度的測定中，各菌株經(jīng)56 ℃、10 min 恒溫水浴處理后，病原菌仍能生長，在57 ℃以上，病原菌全部致死。該菌致死溫度為57 ℃。

2.3 光照對(duì)菌絲生長的影響

研究表明，病原菌在全光照、光暗交替及全黑暗條件下，病原菌菌落生長速率整體上差異不大；3個(gè)菌株均在24 h 全光照下生長速度相對(duì)較快，在12 h 光照/12 h 黑暗下生長速度相對(duì)較慢。圖5

圖5 不同光照下菌落生長直徑變化Fig.5 Comparison of colony growth diameters under different lights

2.4 pH值對(duì)菌絲生長的影響

研究表明，3個(gè)供試菌株在pH值4.0 ～11.0時(shí)均可生長，隨著pH 值的增高，堿性增強(qiáng)，菌絲生長速度加快。其酸堿適應(yīng)范圍廣，最適生長環(huán)境為堿性環(huán)境，對(duì)偏酸性環(huán)境也有較好的耐受性。圖6

圖6 不同pH培養(yǎng)基上菌落生長直徑變化Fig.6 Comparison of colony growth diameters on different pH

2.5 甜菜黃萎病病原菌抑菌藥劑室內(nèi)篩選

研究表明，16種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)病原菌生長均有抑制，各藥劑之間抑制作用有明顯差異；有9種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)病原菌生長具有較好的抑制作用，其中40%多菌靈和450 g/L 咪鮮胺對(duì)病原菌的抑制作用極強(qiáng)，EC50值分別為0.089 1 和0.91 mg/L；30%噁霉靈、30%苯甲丙環(huán)唑、1.8%辛菌胺醋酸鹽次之（EC50：100 ～155 mg/L）；80%代森錳鋅、430 g/L 戊唑醇、80%乙蒜素、125 g/L 氟環(huán)唑再次之（EC50：309 ～838 mg/L）。表2

表2 16種殺菌劑對(duì)甜菜黃萎病菌的毒力（抑菌中濃度）Table 2 Virulence of 16 fungicides to Gibellulopsis nigrescens（concentration in antibacterial）

3 討論

變黑輪枝菌能夠在10 ～35 ℃時(shí)生長，35 ℃時(shí)生長微弱[23]；在pH4時(shí)可以生長，在水瓊脂培養(yǎng)基中生長緩慢，研究的關(guān)于甜菜黃萎病菌的生物學(xué)特性與該研究基本一致。目前關(guān)于黃萎病的生物學(xué)特性和藥劑試驗(yàn)相關(guān)報(bào)道有許多，但關(guān)于甜菜黃萎病菌的生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選研究在國內(nèi)還未見具體報(bào)道，由于試驗(yàn)藥劑篩選結(jié)果僅僅是在病原菌菌絲與藥劑直接接觸產(chǎn)生的抑制效果，不同藥劑作用在植物上的機(jī)理不同，而且藥劑在田間防效還受到寄主植物、病原菌濃度、藥劑的附著滲透能力以及環(huán)境條件的綜合影響[24-25]，并不能完全代表該病菌的田間實(shí)際防效。還需要進(jìn)一步研究確定其抑菌最適濃度和防治效果，進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)。

4 結(jié)論

4.1 甜菜黃萎病病原菌G.nigrescens菌絲生長最適培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基，能利用多種碳源和氮源，乳糖是最佳碳源，硝酸鉀是最佳氮源；病原菌生長溫度在5 ～35 ℃，最適生長溫度為25 ～30 ℃，致死溫度為57 ℃；酸堿度適應(yīng)范圍廣，在pH值4.0 ～11.0均可生長，對(duì)堿性環(huán)境適應(yīng)較好，有較強(qiáng)的耐酸性。

4.2 16種供試藥劑均對(duì)病原菌有顯著不同抑制效果，40%多菌靈和450 g/L咪鮮胺對(duì)病原菌的抑制作用極強(qiáng)，EC50值分別為0.089 1 和0.91 mg/L；30%噁霉靈、30%苯甲丙環(huán)唑、1.8%辛菌胺醋酸鹽次之（EC50：100 ～155 mg/L）次之。