改性殼聚糖基納米核酸藥物的制備及性能研究

林冠權(quán)

(圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)(廣州)有限公司，廣東 廣州 510000)

小干擾核酸(siRNA)[1-2]是一種短片段的雙鏈RNA分子，其基因沉默效應(yīng)具有高特異性和高效性。因此，siRNA可用于治療病毒感染、遺傳性疾病、癌癥等疾病[3-4]。然而，裸露的siRNA在血清中極易被RNase類酶降解，且難以進入細胞，即使進入了細胞，也無法有效地從內(nèi)涵體中逃逸到細胞質(zhì)中。所以，裸露siRNA很難在體內(nèi)發(fā)揮作用以達到治療的效果[5-6]。因此，開發(fā)有效的核酸遞送載體，構(gòu)建合適的納米核酸藥物是提高siRNA基因沉默效應(yīng)，達到其治療效果的主要途徑。

殼聚糖是一種無生物毒性的多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、無免疫原性，能被人體分解吸收，常用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。殼聚糖的分子鏈段上具有多個氨基，氨基質(zhì)子化后形成銨根離子，呈正電性，可與帶負電的核酸通過靜電作用力結(jié)合，因而殼聚糖是良好的核酸載體[7-8]。但殼聚糖的親水性能差，轉(zhuǎn)染效率低的局限性，嚴重阻礙其臨床的應(yīng)用[9]。因此，通過二甲基二烯丙基氯化銨改性殼聚糖，以提高殼聚糖的水溶性；通過構(gòu)建納米核酸藥物，以提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率，達到基因治療的效果。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

實驗儀器：400 MHz核磁共振波普NMR，德國布魯克；Chromate 4300酶標(biāo)儀，Awarenes technology；Quant Studio 3實時熒光定量PCR儀，賽默飛世爾有限公司；1220凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；nano-ZS90納米粒度與zeta電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機，無錫沃信流體設(shè)備科技有限公司；ES1035A電子天平，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司。

實驗試劑：殼聚糖(30000 Da)，上海麥克林；二甲基二烯丙基氯化銨(60wt%水溶液)，上海麥克林；小干擾核酸(siTGF-β1+siCOX-2)，蘇州貝信；過硫酸銨(分析純)，上海麥克林；三聚磷酸鈉(分析純)，上海阿拉丁；冰醋酸(分析純)，上海麥克林；氫氧化鈉(ACS級)，上海阿拉丁；細胞RAN快速提取試劑盒(50T)，北京聚合美。

1.2 二甲基二烯丙基氯化銨改性殼聚糖(CS-g-PDMDAAC，簡稱CP)的制備及表征

取殼聚糖于燒瓶中，加入pH 5的醋酸鈉緩沖溶液，攪拌使其完全溶解，得到12 mg/mL的殼聚糖溶液，加入與殼聚糖質(zhì)量比為6:1的二甲基二烯丙基氯化銨單體，磁力攪拌混勻，在80 ℃下回流10 min。取與殼聚糖質(zhì)量比為0.5:1的過硫酸銨于燒杯中，加入超純水使其完全溶解，得到30 mg/mL的過硫酸銨溶液，再滴加進回流體系中，反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，透析，過濾，冷凍干燥，獲得殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨(CP)干粉。采用核磁共振氫譜對CP的結(jié)構(gòu)進行表征。

1.3 納米藥物的制備

把CP干粉溶于超純水，得到1 mg/mL的CP溶液。把1 mg/mL的siRNA溶液和1 mg/mL的三聚磷酸鈉(ST)置于離心管中混勻，把CP溶液注入離心管中，渦旋混勻，得到siRNA/CP納米核酸藥物。通過瓊脂糖凝膠電泳測試siRNA的結(jié)合情況。

1.4 納米核酸藥物的性能測試

細胞活性測試[10]。把樣品與opti-MEM培養(yǎng)基混合后，置于96孔板中轉(zhuǎn)染6 h，去掉樣品液，用含10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，往96孔板中每孔加入10 μL CCK8，靜置1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm的測試波長中測試細胞的活力情況，重復(fù)三次。

抑制基因表達測試[11]。把樣品與opti-MEM培養(yǎng)基混合后，置于12孔板中轉(zhuǎn)染6 h，移除樣品液，用含10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，通過RT-PCR評估基因敲除效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征分析

圖1是殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨(CP)的核磁共振氫譜圖，4.80 ppm是重水的溶劑峰。1.89 ppm是殼聚糖乙酰基的質(zhì)子峰[12]。3.54 ppm為殼聚糖亞甲基的質(zhì)子峰。3.48 ppm、3.01 ppm處是N上所連-CH3的質(zhì)子峰；3.72 ppm、2.82 ppm是接枝單體聚合物中-CH2-上H的吸收峰；3.37 ppm為接枝單體聚合物中次甲基的質(zhì)子峰；5.56 ppm、5.86 ppm是CH2=CH-上H的多重吸收峰，這可能是聚合物末端鏈終止所形成的雙鍵。這說明DMDAAC已成功接枝于CS主鏈上。

圖1 CS-g-PDMDAAC的1H NMR譜圖

2.2 siRNA/CP納米核酸藥物包裹性能測試分析

siRNA中存在多個磷酸二酯鍵，在水溶液中呈負電；CP中存在多個銨根離子，在水溶液中呈正電。siRNA與CP通過靜電作用自發(fā)結(jié)合形成納米粒子，而siRNA與CP的結(jié)合情況需通過瓊脂糖凝膠電泳觀察。實驗結(jié)果如圖2所示，圖2中CP與siRNA的質(zhì)量比為16:1時有拖帶的現(xiàn)象，說明在此質(zhì)量比下制備的納米核酸藥物不能很好包裹siRNA，存在結(jié)合較差或游離的siRNA。在CP與siRNA的質(zhì)量比為24:1時，沒發(fā)現(xiàn)拖帶和siRNA特征條帶，說明在此質(zhì)量比下CP能很好的與siRNA結(jié)合。三聚磷酸鈉為物理交聯(lián)劑，可進一步壓縮納米顆粒，提高納米核酸藥物的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在CP:ST:siRNA的質(zhì)量比分別為24:2:1和24:1:1時，均沒發(fā)現(xiàn)結(jié)合較差和游離的siRNA。通過凝膠滯留分析可篩選出納米核酸藥物中包裹性能較好的比例配方，除了CP與siRNA的質(zhì)量比為16:1的配方以外，上述配方得到的納米核酸藥物可很好的包裹siRNA，達到保護siRNA的作用。根據(jù)圖3粒徑分布圖可知，CP:ST:siRNA的質(zhì)量比為24:2:1時，納米核酸藥物的粒徑為180 nm。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 siRNA/CP納米核酸藥物粒徑分布圖

2.3 細胞活性分析

LIPO2000是一種適用于基因表達和基因沉默的高性能轉(zhuǎn)染試劑。在圖4細胞活性圖中得知，LIPO2000組的細胞毒性較大，細胞活性為63%。CP組的細胞活性為101%，ST組的細胞活性為118%，說明CP載體和ST離子交聯(lián)劑對細胞的生長具有促進作用，CP和ST兩者對細胞具有無毒性。雖然CP與ST混合后發(fā)現(xiàn)，CP:ST組的細胞活性為87%，具有低毒性，但與LIPO2000組對比，CP:ST組的安全性也具有很大優(yōu)勢。與LIPO2000組相比， siRNA/LIPO2000組的細胞活性下降約10%，說明siRNA對BXPC3細胞的活力具有一定的抑制作用。同理，與CP組相比，CP:ST:siRNA(24:2:1)組的細胞活性下降了20%。從細胞活性的下降程度對比，CP:ST:siRNA(24:2:1)組優(yōu)于siRNA/LIPO2000組，這主要源于CP的高安全性及良好的轉(zhuǎn)染效率。

圖4 細胞活性結(jié)果圖

2.4 抑制目的基因表達性能分析

siRNA使用的是siTGF-β1與siCOX-2兩兩混合的小核酸，siRNA通過與特定的mRNA互補結(jié)合后切割mRNA，阻斷了mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的表達路線，從而沉默了該編碼基因的表達，達到治療的效果。圖5是mRNA表達水平圖，GFP組是陰性對照，對于目的基因的表達沒有任何的抑制作用，siRNA/LIPO2000組是陽性對照，TGF-β1與COX-2的mRNA表達水平均有不同程度的下降,這源于LIPO2000具有高效的轉(zhuǎn)染性能。CP:ST:siRNA(24:1:1)組的兩組mRNA表達抑制水平不及陽性對照組，CP:siRNA(24:1)組的COX-2的mRNA表達抑制水平不及陽性對照組。24:2:1(CP:ST:siRNA)組的兩組mRNA表達抑制水平均優(yōu)于陽性對照組，說明CP載體的轉(zhuǎn)染效率在一定程度上優(yōu)于LIPO2000，在CP:ST:siRNA質(zhì)量比為24:2:1時制備的納米核酸藥物，其具有較高的抑制目的基因表達效率。

圖5 mRNA表達水平結(jié)果圖

3 結(jié) 論

siRNA具有特異性及高效性，對于癌癥及遺傳學(xué)疾病具有良好的治療效果，但裸siRNA難以完整地進入細胞內(nèi)部以發(fā)揮治療的作用。需要通過構(gòu)建藥物/載體復(fù)合體，保護siRNA免被酶分解的同時，提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率。

通過接枝聚合制備殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨核酸載體，與siRNA、離子交聯(lián)劑ST通過靜電作用力結(jié)合型成納米核酸藥物。結(jié)果顯示，CP:ST:siRNA的質(zhì)量比分別為24:2:1時，能很好的包裹siRNA。CP具有較高的安全性，能促進細胞的生長。CP:ST:siRNA的質(zhì)量比為24:2:1時，納米核酸藥物具有良好的抑制目的基因表達的作用。本文制備的核酸載體有望發(fā)展為平臺性技術(shù)，為多種核酸藥物的有效遞送提供可能。