高效液相色譜法分離及測(cè)定茶葉中的茶堿*

司曉喜，楊語(yǔ)喆，張雪花，劉志華，李振杰，何 沛，張鳳梅，許志剛

(1 云南煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2 昆明理工大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650500)

茶葉品種繁多, 含有多種有益健康的有機(jī)成分、微量元素和豐富的生物堿。茶堿雖然在茶葉中的含量遠(yuǎn)小于咖啡堿，但茶堿卻具有重要的藥用價(jià)值，由于茶堿溶解度低，制成藥劑時(shí)一般選擇易溶的茶堿衍生物，如氨茶堿等。茶堿的化學(xué)名為1,5-二甲基黃嘌呤(1,5-Dimethylxanthine)[1]。茶堿類藥物具有擴(kuò)張支氣管、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制血小板活性等作用, 是治療哮喘的常用藥物[2]。

測(cè)定茶堿的方法包括容量分析法、紫外分光光度法(UV)[3]、高效液相色譜法 (HPLC)[4-5]等。茶堿具有良好的紫外吸收, 采用UV法測(cè)定茶堿含量的報(bào)道較多。但茶堿與可可堿在270～275 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收, 傳統(tǒng)UV法無(wú)法消除可可堿的干擾。在可可堿和茶堿同時(shí)存在情況下，Abuirjeie等[6]采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法和二級(jí)導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定茶堿。與UV法的局限與導(dǎo)數(shù)光譜法的復(fù)雜計(jì)算相比較, HPLC法更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷。茶葉中不僅含有可可堿, 還可能有咖啡因等雜質(zhì)干擾, UV法無(wú)法排除相互干擾, 但HPLC法可對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離和準(zhǔn)確定量[7]。在樣品前處理環(huán)節(jié)，較低的水浴溫度不利于茶堿的釋放，隨著水浴溫度的增加，茶堿更易于溶出[8]。本文采用沸水提取三種茶葉種的茶堿，結(jié)合高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)色譜分離條件進(jìn)行了測(cè)定，所建立的分析方法能有效測(cè)定茶葉種的茶堿含量。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司；C18色譜柱(Venusil MP, 5 μm, 4.6 mm×250 mm)；FA2004電子天平，上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；PS-10A超聲波清洗機(jī)，深圳市潔康洗凈電器有限公司；HH-34智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市英峪高科儀器廠。甲醇為色譜級(jí)，其它試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。茶葉樣品購(gòu)于昆明當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 分析方法

1.2.1 樣品處理方法

稱取干燥茶葉1.0 g，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入60 mL煮沸的蒸餾水，并保持微沸狀態(tài)15 min，趁熱抽濾，濾渣用40 mL沸水重復(fù)提取2次，合并3次濾液，濾液冷卻至30 ℃即可進(jìn)行色譜分析[9]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 mg 茶堿標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL 的比色管中，加入甲醇溶液稀釋至50 mL后超聲處理1 min制得100 mg/L的茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級(jí)稀釋，得到濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 色譜分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀檢測(cè)茶堿，色譜柱為C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，采用甲醇-水為流動(dòng)相，并對(duì)流動(dòng)相的組成、流速和柱溫分別進(jìn)行優(yōu)化。定量分析時(shí)，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，采用峰面積對(duì)濃度的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步分析實(shí)際樣品種的茶堿。所有進(jìn)樣分析的體積均為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相比例的優(yōu)化

茶堿的極性較強(qiáng)，在C18柱上的保留弱，色譜出峰較早。流動(dòng)相中甲醇和水的比例由40:60向10:90變化時(shí)，出峰時(shí)間不斷增大，峰面積變化不大，但峰寬逐漸增大(如表1所示)。在流動(dòng)相比例為20:80時(shí)，峰面積與出峰時(shí)間適中(如圖1所示)，且目標(biāo)峰與溶劑雜峰有較好的分離。因此，選擇取流動(dòng)相中甲醇和水的比例為20:80。

表1 流動(dòng)相中甲醇-水的比例對(duì)茶堿分離的影響

圖1 流動(dòng)相中甲醇-水的比例優(yōu)化

2.1.2 流速的優(yōu)化

以比例為20:80甲醇-水為流動(dòng)相，進(jìn)一步優(yōu)化流速。流速由0.5 mL/min向0.9 mL/min變化時(shí)，出峰時(shí)間不斷減小，峰寬不斷減小，峰面積也不斷減小，且壓強(qiáng)逐漸增大(如表2所示)。當(dāng)流速為0.7 mL/min時(shí)，峰面積和出峰時(shí)間適中(如圖2所示)，壓強(qiáng)也不會(huì)太高。因此，選取0.7 mL/min為最優(yōu)流速。

表2 流速對(duì)茶堿分離的影響

圖2 不同流速對(duì)茶堿分離的影響

2.1.3 柱溫的優(yōu)化

進(jìn)一步優(yōu)化色譜柱的柱溫， 柱溫15 ℃向35 ℃變化時(shí)，出峰時(shí)間逐漸減小，峰寬也逐漸減小，峰面積變化不大，壓強(qiáng)逐漸減小(如表3所示)。柱溫為35 ℃時(shí)，出峰時(shí)間最佳(如圖3所示)，峰面積最大，壓強(qiáng)適中。因此，選取柱溫為35 ℃。

表3 柱溫對(duì)茶堿分離的影響

圖3 不同柱溫下茶堿的色譜分離圖

2.2 分析方法的建立

流動(dòng)相為甲醇-水，兩者體積比為20:80，流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積均為20 μL。線性方程為Y=-0.094+1.24X，線性范圍：0.05～15 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，檢出限為0.017 mg/L。

2.3 樣品分析

對(duì)從市面上隨機(jī)購(gòu)買的三種茶葉樣品鐵觀音，綠茶，紅茶進(jìn)行分析，先按照1.2.1的方法進(jìn)行樣品處理，再進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在鐵觀音與綠茶中檢出了茶堿，紅茶中未檢出茶堿。檢出濃度在0.459～5.755 mg/L之間。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的適用性，在上述樣品分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在茶葉樣品中添加一定量的茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品的加標(biāo)濃度分別為0.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L。按照1.2.1的方法進(jìn)行樣品處理，樣品超聲處理3 min，經(jīng) 0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣20 μL，平行測(cè)定三組。扣除本底值后的回收率在88.9%～112.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.1%～5.4%之間。

圖4 實(shí)際茶葉樣品和加標(biāo)樣品的色譜分析圖

表4 三種茶葉樣品中茶堿的測(cè)定及加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié) 論

建立了沸水提取-高效液相色譜法測(cè)定不同茶葉中的茶堿，對(duì)色譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括流動(dòng)相組成、流速和柱溫。在最優(yōu)的色譜條件下，測(cè)得茶葉中茶堿的濃度在0.459～5.755 mg/L之間，加標(biāo)回收率在88.9%～112.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～5.4%之間。