核酸分析儀校準(zhǔn)結(jié)果不確定度的評(píng)定

陳 颯，張 倩

(中檢西北計(jì)量檢測(cè)有限公司，陜西 西安 710068)

核酸是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的總稱(chēng)，一直被認(rèn)為是存儲(chǔ)和傳遞遺傳信息的分子。核酸是細(xì)胞的一種主要成分，支配著蛋白質(zhì)的合成，主宰著人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等一切重大的生命活動(dòng)，對(duì)人體的新陳代謝、免疫功能調(diào)節(jié)都起著重要的、決定性的作用。核酸分析儀可用于單個(gè)和多重PCR片段、限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA、合成的寡聚核苷酸、總RNA等片段長(zhǎng)度和濃度的分析。通常由進(jìn)樣器、毛細(xì)管/微芯片、熒光檢測(cè)光學(xué)部件、微電路控制部件、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。目前，新型冠狀病毒肺炎是全球都投入其中的一場(chǎng)戰(zhàn)役，核酸檢測(cè)過(guò)程包括標(biāo)本處理、核酸提取，進(jìn)行PCR檢測(cè)等多個(gè)步驟，核酸分析儀是使用中必不可少的一個(gè)部分，故需通過(guò)計(jì)量保證核酸分析儀結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性。測(cè)量不確定度是表征計(jì)量結(jié)果的一個(gè)重要參量。

測(cè)量不確定度簡(jiǎn)稱(chēng)不確定度，是指根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量量值分散性的非負(fù)參數(shù)。這種分散性有兩種情況：(1)由于各種隨機(jī)性因素的影響，每次測(cè)量得到的值不是同一個(gè)值，而是以一定概率分布分散在某個(gè)區(qū)間內(nèi)的許多值。(2)雖然有時(shí)實(shí)際上存在著一個(gè)恒定不變的系統(tǒng)性影響，但由于不知道其值，也只能根據(jù)現(xiàn)有的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為它以某種概率分布存在于某個(gè)區(qū)間內(nèi)，可能存在于區(qū)間內(nèi)的任意位置，這種概率分布也具有分散性。為了表征測(cè)得值的分散性，測(cè)量不確定度用標(biāo)準(zhǔn)偏差或其特定倍數(shù)表示，或者用說(shuō)明了包含概率的區(qū)間半寬度表示，用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示的測(cè)量不確定度稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)不確定度，測(cè)量不確定度表示為標(biāo)準(zhǔn)偏差的特定倍數(shù)或給定概率下分散區(qū)的半寬時(shí)稱(chēng)擴(kuò)展不確定度。測(cè)量不確定度一般由若干分量組成。其中一些分量可根據(jù)一系列測(cè)得值的統(tǒng)計(jì)分布，按測(cè)量不確定度的A類(lèi)評(píng)定方法(統(tǒng)計(jì)方法)進(jìn)行評(píng)定，并用實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差表征。而另一些分量則可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或其他信息假設(shè)的概率分布，按測(cè)量不確定度的B類(lèi)評(píng)定方法(非統(tǒng)計(jì)方法)進(jìn)行評(píng)定，也用標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。通常，對(duì)于一組給定的信息，測(cè)量不確定度是與賦予被測(cè)量的量值相聯(lián)系的。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》要求以及JJF1817-2020《核酸分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》，對(duì)核酸分析儀校準(zhǔn)過(guò)程中產(chǎn)生的片段濃度示值誤差和片段長(zhǎng)度示值誤差進(jìn)行評(píng)定，為正確評(píng)價(jià)和使用校準(zhǔn)結(jié)果提供了更為合理和科學(xué)的依據(jù)。

1 測(cè)量過(guò)程簡(jiǎn)述

1.1 測(cè)量依據(jù)

JJF1817-2020《核酸分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》。

1.2 測(cè)量環(huán)境條件

(1)環(huán)境溫度：15～30 ℃;

(2)相對(duì)濕度：不大于80%;

(3)其他要求：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足分析儀安裝的要求，不得存在強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)和電磁干擾，并確保校準(zhǔn)過(guò)程中環(huán)境溫度變化小于3 ℃。

1.3 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)[1]

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

表1 計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1.3.2 校準(zhǔn)用試劑和溶液

(1)純水：符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水;

(2)三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)：分析純;

(3)乙二胺四乙酸(EDTA)：分析純;

(4)TE緩沖液的配制

用0.00001 g的天平稱(chēng)量1.576 g的Tris-HCl，0.292 g的EDTA，加入至1 L的三角瓶?jī)?nèi)加入700 mL一級(jí)水，待全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.0，然后用1 L的量筒定容。

(5)示值誤差和重復(fù)性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液

用TE緩沖液將DNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為2 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 配套設(shè)備

表2 配套設(shè)備

1.4 被校對(duì)象[2-3]

核酸分析儀：型號(hào)NANODROP 2000C；廠(chǎng)家Thermo 本規(guī)范適用于基于凝膠電泳原理對(duì)核酸片段的長(zhǎng)度和濃度進(jìn)行分析的核酸分析儀的校準(zhǔn)，適用于核酸片段長(zhǎng)度范圍為100～1000 bp。

1.5 測(cè)量方法

采用分析儀直接測(cè)定DNA片段含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)稱(chēng)值進(jìn)行比較。

1.6 測(cè)量過(guò)程[4]

(1)核酸分析儀在校準(zhǔn)前應(yīng)將低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配套試劑提前從冰箱拿出，必須檢查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配套試劑有效使用日期，使用有效期內(nèi)的試劑并且確保其在使用前平衡至室溫。

(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配套試劑在平衡30 min后按1.3.2的要求配制。

(3)試劑配制完成后打開(kāi)核酸分析儀，預(yù)熱10 min，檢查氣瓶的壓力。

(4)片段長(zhǎng)度及片段濃度示值誤差校準(zhǔn)：預(yù)熱完成，儀器自檢通過(guò)后，參照儀器使用說(shuō)明書(shū)，用移液器將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到校準(zhǔn)板中，按表3所示準(zhǔn)備校準(zhǔn)板，然后將準(zhǔn)備好的校準(zhǔn)板置于核酸分析儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)量10次，記錄10次片段長(zhǎng)度及片段濃度測(cè)定值，10次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值減去標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值，即為核酸分析儀的片段長(zhǎng)度和片段濃度的示值誤差。計(jì)算出10次測(cè)量結(jié)果相對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為片段長(zhǎng)度和片段濃度的重復(fù)性。

表3 12聯(lián)排管加樣排布方式

1.7 評(píng)定結(jié)果的使用

在符合上述條件下的測(cè)量結(jié)果，一般可直接使用本不確定度的評(píng)定結(jié)果。

2 數(shù)字模型[1]

長(zhǎng)度校準(zhǔn)結(jié)果的示值誤差按照式(1)計(jì)算：

(1)

濃度校準(zhǔn)結(jié)果的示值誤差按照式(2)計(jì)算：

(2)

3 測(cè)量不確定度來(lái)源分析[5]

3.1 長(zhǎng)度示值誤差的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度；

環(huán)境條件、人員操作和被校儀器等各種隨機(jī)因素引入的重復(fù)性不確定度。

3.2 濃度示值誤差的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度；

環(huán)境條件、人員操作和被校儀器等各種隨機(jī)因素引入的重復(fù)性不確定度。

4 測(cè)量不確定度的評(píng)定[5]

4.1 長(zhǎng)度示值誤差的不確定度評(píng)定

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度u1(Cs1)的評(píng)定

采用320BP寡聚DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值相對(duì)擴(kuò)展不確定度為7.1%，包含因?yàn)閗=2。則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：

u1(Cs1)=3.6%/2=1.8%

(3)

由環(huán)境條件、人員操作和被校儀器等各種隨機(jī)因素引入的重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可采用A類(lèi)評(píng)定。

對(duì)被校核酸分析儀按儀器說(shuō)明書(shū)，將準(zhǔn)備好的校準(zhǔn)板置于分析儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，本次使用300bp的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行示值校準(zhǔn)，記錄10次片段長(zhǎng)度及片段濃度測(cè)定值。并按式(4)計(jì)算各校準(zhǔn)點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，各校準(zhǔn)點(diǎn)的具體測(cè)量數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 各校準(zhǔn)點(diǎn)A類(lèi)評(píng)定結(jié)果

(4)

(5)

4.1.3 長(zhǎng)度示值誤差合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算

測(cè)量不確定度分量匯總及計(jì)算表如表5所示。

表5 標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總表

長(zhǎng)度示值誤差合成不確定度為：

4.1.4 長(zhǎng)度示值誤差擴(kuò)展不確定度U

取包含因子k=2，則：

U=k×uC=4%

4.2 濃度示值誤差的不確定度評(píng)定

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ccons)

進(jìn)行含量校準(zhǔn)時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液引入的不確定度u(Ccons)包含了未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度u(Cy-con)和稀釋過(guò)程引入的不確定度，未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的證書(shū)提供的擴(kuò)展不確定度U(Ms)和包含因子k(Ccon)根據(jù)下式計(jì)算：

(6)

式中：u(Cy-con)——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

U(Cy-con)——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)提供的擴(kuò)展不確定度

k(Cy-con)——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)提供的包含因子，通常為2

320 bp標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋前的含量標(biāo)準(zhǔn)值為110.6 mg/kg，其定值相對(duì)擴(kuò)展不確定度為7.1%，則換算為絕對(duì)誤差引入的不確定度為3.92 ng/μL，(k=2),則由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel(Cy-con)=0.01772

采用天平稱(chēng)量稀釋?zhuān)♂屵^(guò)程引入的不確定度即天平稱(chēng)量的不確定度包括天平偏載誤差、天平稱(chēng)量重復(fù)性、示值誤差，合成后由天平稱(chēng)量稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0028。則稀釋后的工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度為：

urel(Ccons)=0.01794

稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(Ccons)=0.036 ng/μL

在校準(zhǔn)中DNA含量測(cè)定結(jié)果的值分別為2.51 ng/μL、2.66 ng/μL、2.75 ng/μL、2.65 ng/μL、2.58 ng/μL、2.51 ng/μL、2.74 ng/μL、2.69 ng/μL、2.54 ng/μL、2.78 ng/μL，單次測(cè)量的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s(xi)為：

則測(cè)量結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2.3 測(cè)量不確定度分量匯總及計(jì)算

表6 標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總表

合成不確定度為：

4.2.4 濃度示值誤差擴(kuò)展不確定度U

取包含因子k=2，則：

U=k×uC=0.11 ng/μL

5 結(jié) 論

(1)由上述不確定度評(píng)定過(guò)程可知，核酸分析儀校準(zhǔn)不確定度[5]主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度和測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度的評(píng)定采用了B類(lèi)不確定度評(píng)定的評(píng)定方法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度的評(píng)定采用了A類(lèi)不確定度評(píng)定的評(píng)定方法進(jìn)行計(jì)算。

(2)在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理過(guò)程中，應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量時(shí)可選擇精度更高的電子天平，對(duì)儀器設(shè)備定期進(jìn)行質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)人員校準(zhǔn)時(shí)可適量增加平行試驗(yàn)的次數(shù)來(lái)降低不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采買(mǎi)時(shí)要注重考查等級(jí)及不確定度，從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，減少不確定度，最終優(yōu)化和完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理。

(3)本文不確定度的評(píng)定方法采用GUM法,先是分析不確定度來(lái)源和建立測(cè)量模型，然后評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度u，再計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uC，最后取包含因子2，計(jì)算出擴(kuò)展不確定度，最終結(jié)果為：長(zhǎng)度示值誤差擴(kuò)展不確定度U=4%(k=2)；長(zhǎng)度示值誤差擴(kuò)展不確定度U=0.11(ng/μL)(k=2)。