糖尿病腎病患者外周血Th1/Th2變化及其與PI3K/AKT通路相關性

劉倩穎 張 美

江蘇省南京市江寧醫院 211100

糖尿病腎病(DN)是機體長時間高糖狀態導致的蛋白尿以及腎小球濾過率進行性降低，是糖尿病的常見并發癥和主要死亡原因之一，嚴重威脅患者的生命安全[1]。臨床對DN的病因和發病機制認識尚不完全，目前主要認為與遺傳因素和糖代謝異常、腎臟血流動力學改變以及免疫炎癥因子等有關。相關研究表明，機體免疫平衡中的Th1/Th2細胞平衡可能影響患者糖尿病腎病發展進程，Th1細胞和Th2細胞是由T輔助細胞(CD4+細胞)根據機體發生不同優勢免疫應答分泌的細胞因子不同分化而來，生理條件下,機體的Th1細胞和Th2細胞維持一定比例，從而保持人體免疫平衡，當患者發生免疫異常時，CD4+細胞的分化偏向其中一方，Th1/Th2平衡發生變化[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)PI3K和蛋白激酶B(PKB/AKT)已被證實是體內關鍵的胰島素信號分子，PI3K-AKT信號通路能促進胰島素刺激的葡萄糖攝取與儲存，在有胰島素刺激的情況下，可啟動PI3K-AKT信號途徑，解除對糖原合酶(GS)的抑制，促進糖原的合成[3]。因此，本文通過對比健康體檢者與DN患者血清中Th1/Th2細胞平衡的變化和血清中PI3K、AKT濃度差異，探究糖尿病腎病患者外周血中Th1/Th2變化及其與PI3K/AKT通路的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年9月—2021年9月我院治療的糖尿病腎病患者100例為觀察組，其中男48例，女52例，平均年齡(51.25±7.86)歲，體質指數23.45±3.36。選取同期來我院體檢的78例健康者為對照組，其中男38例，女40例，平均年齡(51.84±7.43)歲，體質指數23.18±3.42。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已通過醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 選擇標準 納入標準：(1)糖尿病腎病的診斷參照中華醫學會糖尿病學分會2014年制定的《糖尿病腎病防治專家共識》；(2)對本次研究內容知情并簽署知情同意書者。排除標準：(1)合并其他嚴重慢性疾病或惡性腫瘤者；(2)嚴重精神障礙或溝通障礙無法配合治療者；(3)合并自身免疫疾病或感染者；(4)合并心衰、酮癥酸中毒等嚴重并發癥者。

1.3 方法

1.3.1 Th1/Th2細胞水平測定：(1)測定原理：Th1細胞主要分泌γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，介導細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5、白細胞介素-10等，介導體液免疫反應。由于生理狀況下T細胞未受到刺激，所分泌的細胞因子非常少，可忽略不計，而IFN-γ是Th1分泌的最特異的細胞因子，IL-4是Th2分泌的最特異的細胞因子。因此在測定Th1/Th2細胞水平時，可采用Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ與Th2細胞分泌的細胞因子IL-4的比值近似表達Th1/Th2比率。(2)具體步驟：①標本采集：所有觀察對象均于早晨采集空腹靜脈血6ml，取3ml外周靜脈血于肝素鈉抗凝管，加入淋巴細胞分離液，離心(3 000r/min,10min)后，取外周血單個核細胞(PBMC)懸液，稀釋PBMC懸液至1×107/ml，將稀釋后的PBMC加入細胞培養板，然后向培養板內加入250×PMA/lonomycin和 250×Monensin/BFA，將其混合均勻后放入充滿5%濃度CO2恒定溫度37℃的培養箱中培養6h。然后加入anti-CD3 FITC和anti-CD4 PERCP對PMBC表面抗原染色，采用 FIX&PERM Reagent A破膜，用anti-IFN-γAPC和anti-IL-4 PE做細胞內因子染色，用同型IgG抗體對照，以流式細胞儀(購自美國貝克曼公司，型號：FC500A)檢測INF-γ的 CD4細胞、IL-4的CD4細胞所占百分比，近似代表Th1、Th2所占百分比。②取3ml外周血置于促凝管中，離心(3 000r/min,10min)后，取上清與無菌EP管中，使用IL-4和 IFN-γ 的 ELISA 試劑盒(杭州賽基生物科技公司成品試劑盒)檢測細胞因子IFN-γ、IL-4的外周血表達水平，具體步驟按照說明書進行。

1.3.2 PI3K/Akt通路測定：(1)提取總RNA：所有受試者均于清晨抽取空腹靜脈血2ml，3h內完成總RNA提取,后凍存于-80℃冰箱中。采用RNA提取試劑盒(吸附柱法)提取總RNA，采用紫外—可見分光光度法測定Z總RNA的濃度和純度，應用瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳(180mV,5min)，判定RNA完整性，取400ng總RNA待用。(2)逆轉錄聚合酶鏈反應與相對定量評估：采用逆轉錄試劑盒和Oligod(T)逆轉錄RNA，反應條件為42℃水浴20min+95℃水浴3min，反應結束后將其生成物保存與-80℃，等待檢測。用QuantiFast ProbeAssays、QuantiFast ProbePCRKit(均購自QiagenCo,Gemany)和ABIPrism7500型PCR儀(ABI公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。探針測定AKT1引物、HsAKT1PQF1QuantiFast與PI3KCB引物、HsPI3KCBQF1QuantiFast,應用GADPH引物及探針為內部對照，PCR反應體系：總體積25μl,反應條件為40個循環，94℃預變性 5min,94℃變性30s，65℃退火30s。均平行測定3次后獲取平均Ct值,按Ct值對斜率及截距進行計算,并繪制標準曲線。采用雙標準曲線法對PI3KmRNA及AKTmRNA表達水平進行分析。

1.4 評價標準 (1)對比兩組外周血中IFN-γ及IL-4的表達水平；(2)對比分析兩組患者外周血中 Th1/Th2 細胞比例變化；(3)對比分析兩組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA的表達水平；(4)比較糖尿病腎病患者外周血IFN-γ、IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA的相關性。

2 結果

2.1 兩組外周血IFN-γ、IL-4水平比較 觀察組的IFN-γ水平均較對照組高，IL-4水平較對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血IFN-γ、IL-4水平比較

2.2 兩組外周血中Th1/Th2細胞比例比較 觀察組外周血Th1細胞多于對照組，Th2細胞對照組低，Th1/Th2較對照組高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者外周血中Th1/Th2細胞比例比較

2.3 兩組外周血PI3K mRNA、AKT mRNA比較 觀察組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血PI3K mRNA、ATK mRNA表達水平比較

2.4 IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2值與PI3K mRNA、AKT mRNA的相關性 外周血IFN-γ水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相關(r=0.131、0.032，P<0.05)，外周血IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈負相關(r=-0.132、-0.212，P<0.05)。

3 討論

免疫因素是糖尿病及其并發癥的一個重要因素，天然免疫中補體系統和模式識別受體之間關系密切、相互作用機制繁雜，在糖尿病腎病的發病過程中有關鍵性作用[4]。T細胞根據其分泌的細胞因子和功能不同，在外界因素的刺激下，分化為Th1細胞和Th2細胞，Th1/Th2細胞平衡是維持機體健康的重要免疫機制，兩種細胞互為抑制，處于動態平衡中。研究表明，Th1/Th2細胞平衡與糖尿病腎病關系密切，Th1細胞可促進糖尿病的發生，而Th2細胞對糖尿病有保護作用[5]。PI3K/AKT信號通路作為調控細胞增殖、轉運和生存的重要通路，可以從整體上降低細胞的生長阻礙和細胞凋亡，并提高細胞的存活能力和繁殖能力[6]。有研究證實PI3K/AKT信號通路是胰島素的主要信號通路，胰島素刺激引起PI3K信號傳導途徑的作用下降，使用PI3K/AKT 信號通路抑制劑能夠引起胰島素抵抗[7]。

本文通過對比分析兩組患者外周血IFN-γ、IL-4水平和Th1/Th2變化,結果顯示觀察組患者Th1細胞占比及Th1/Th2均較對照組高，而Th2細胞占比較對照組低。提示在糖尿病腎病患者中Th1細胞參與炎癥反應過程，體內IFN-γ等炎癥因子水平升高，促進糖尿病腎損傷的發生，而IL-4水平在這一過程中有降低。在DN患者腎損傷過程中，細胞免疫反應較體液免疫反應更占據優勢，IFN-γ升高促進B淋巴細胞活化，導致NK細胞過度激活進而過度損傷胰島β細胞，導致糖尿病腎病。比較兩組外周血PI3K mRNA、AKT mRNA水平，結果表明觀察組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于對照組，將其與外周血IFN-γ、IL-4細胞水平進行相關性分析，結果表明外周血INF-γ水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相關，外周血IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈負相關。糖尿病腎病患者外周血中PI3K mRNA和AKT mRNA水平均高于健康對照組，提示PI3K/AKT信號通路的表達與糖尿病腎病進展相關。這與祝再然等[8]的研究結論一致，認為PI3K通過激活其下游的重要靶蛋白AKT進一步調節下游信號分子參多種生理病理活動，在糖代謝過程中，胰島素可激活胰島β細胞內蛋白酪氨酸激酶(PTK)，進而通過胰島素受體底物蛋白(IRS)激活PI3K，而PI3K可以激活其下游信號分子AKT,激活AKT后通過將細胞內葡萄糖運載體囊泡轉移固定到細胞膜從而發揮降低血糖的作用。而Th1細胞因子(IFN-γ)通過促進PI3K/AKT信號通路的表達來促進糖尿病腎病進展。而Th2細胞因子(IL-4)與PI3K mRNA和AKT mRNA水平呈負相關，提示Th2細胞因子可能通過抑制PI3K/AKT信號通路來預防或延緩糖尿病患者腎損傷的發生。

綜上所述，糖尿病腎病患者外周血Th1細胞水平升高，而Th2細胞水平下降，且Th1/Th2水平升高可能過度激活PI3K/AKT信號通路，導致糖尿病腎病。