黑色素瘤來源的外泌體miR-23a 在黑色素瘤達拉非尼耐藥中的機制研究

羅單

惡性黑色素瘤 (malignant melanoma,MM) 是一種起源于黑色素細胞或黑色素細胞源性細胞的皮膚腫瘤［1］。盡管惡性黑色素瘤僅占所有皮膚腫瘤的小部分,但由于其不良的預后和較高的死亡率(占所有皮膚癌死亡人數的65%),目前已經成為全世界最具侵害性和最易致命的皮膚癌之一,同時也是全球人類健康不容忽視的危害。達拉非尼是一種已經被批準使用于治療Ⅲ/Ⅳ期和轉移性惡性黑色素瘤的小分子靶向藥物,但是根據多項報道認為,惡性黑色素瘤患者在服藥以后會較快出現耐藥性,因此對于臨床效果來說是有一定限制的［2］。實際上,目前很多專家認為耐藥性已經成為了治療惡性黑色素瘤的主要挑戰之一,因此要找到耐藥機制。當然,癌癥的耐藥機制是復雜多元化的,很多研究認為主要原因就是機體氧化應激反應、細胞自噬與凋亡,以及遺傳的不穩定性所導致的［3,4］。本研究從自噬角度出發,對黑色素瘤來源的外泌體miR-23a 在黑色素瘤達拉非尼耐藥中的機制進行分析和研究。

1 材料與方法

1.1 材料 購買的細胞為美國American Type Culture Collection 的惡性黑色素瘤細胞系A375；所用主要實驗試劑包含如下：美國Sigma-Aldrich 公司的達拉非尼,美國Cell Signaling Technology 生產的抗裂解PARP、抗LC3Ⅰ/Ⅱ和物種特異性二抗,美國LI-COR Biosciences公司生產的DMEM 培養基,美國Thermo Fisher Scientific 公司生產的胎牛血清和雙抗；所用主要儀器設備包含如下：美國Nikon 公司生產的PCM 2000 共聚焦顯微鏡,上海力申公司生產的臺式高速離心機,美國BioTek 公司生產的酶標儀,美國伯樂公司生產的蛋白電泳儀、SDS-PAGE 凝膠電泳儀,上海培清科技有限公司生產的化學發光儀。

1.2 方法

1.2.1 達拉非尼處理 選擇惡性黑色素瘤細胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達拉非尼對其進行24 h 處理。

1.2.2 模擬物轉染 將miR-23a 模擬物轉染到達拉非尼耐藥性最強的A375 細胞株上,使其呈現miR-23a過表達。將A375 細胞株在6 孔培養板中接種,每個孔中為對數生長期的細胞20 萬個,細胞生長融合到60%左右就進行轉染操作,取其中A 管加入miR-23a mimics(miR-23a 組),然后按照細胞培養條件進行培養,取B 管加入15 μl 脂質體Lipofectamine2000,按照細胞培養條件進行培養。兩組均培養48 h 以后對細胞的上清液加以收集。

1.2.3 利用Western Blot 和qPCR 檢測處理前后A375 細胞中的LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達水平 qPCR 檢測miR-23a 表達,首先提取外周血單核血細胞中的總RNA,把組織樣本放在室溫環境下靜置5 min,然后放入A 組各管里面進行震蕩混勻,在室溫下孵育20 min。在培養板的細胞中,分別均勻滴入上述轉染混合液,并慢慢搖勻,在37℃培養箱中孵育過夜。然后根據TaKaRa 公司的反轉錄試劑盒操作說明書進行具體操作。

Western Blot 檢測LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達蛋白水平,嚴格按照操作說明書進行操作,并將印記膜接觸膠片,根據熒光強弱進行不同的曝光,12 h 后洗片,然后用圖像分析軟件進行灰度值的分析,以及參用內參灰度值對蛋白相對含量進行比較。

1.3 觀察指標 ①檢測和比較惡性黑色素瘤細胞內被用不同濃度的達拉非尼處理前后LC3Ⅰ/Ⅱ表達的水平。②檢測和比較耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達的水平。③分析miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；相關性檢驗采用Pearson 線性相關分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 達拉非尼處理前后A375 細胞系中LC3Ⅰ/Ⅱ的表達 將A375 細胞系用不同濃度的達拉非尼(0、30、100、300 nM) 處理,收集細胞。經Western Blot檢測LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達水平,并行qPCR 分析,發現LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達拉非尼濃度的升高而增加,說明達拉非尼以劑量依賴性方式顯著激活了自噬信號。見圖1。

圖1 LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達水平WB 圖

2.2 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平 轉染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的 表達水平均高于轉染前,差異具有統計學意義 (P＜0.05)。見表1。

表1 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平比較()

表1 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平比較()

注：與轉染前比較,aP＜0.05

2.3 miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性分析 Pearson 線性相關分析結果顯示,miR-23a 表達水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(P＜0.05),與ROS 無相關性(P＞0.05)。見表2。

表2 miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性分析

3 討論

黑色素瘤是一種具有高侵襲性及死亡率的惡性腫瘤,早期診斷并通過手術切除可以達到較好的臨床預后,而發生轉移的黑色素瘤由于缺乏有效的治療手段,生存率極低。我國較多患者都受到疾病意識、經濟和醫療因素的影響導致診斷的時候已經有不同程度的轉移,所以對黑色素瘤的早期識別,以及對有效的晚期治療途徑的尋找就顯得比較重要［5］。目前達拉非尼已經被認為是治療轉移性黑色素瘤的一線化療藥物,50%～60%接受達拉非尼治療的患者可以顯著延長無進展生存期和總生存期。盡管,達拉非尼擁有如此良好的療效,但對于藥物的耐受限制了患者的長期有效治療。外泌體是由多種類型細胞分泌的一種細胞外囊泡,通過其載體作用將內容物從分泌細胞轉移到受體細胞以實現細胞間的通信交流。基于其獨特的生物特性和功能,外泌體已被應用于黑色素瘤的診斷、治療和預后評價等方面［6］。達拉非尼是一種新型的治療黑色素瘤的有效藥物,可以通過阻止BRAF 基因突變縮小黑色素瘤。這類靶向藥物可以明顯延長BRAF 基因突變的黑色素瘤患者的生存時間,然而大部分患者會產生一定的達拉非尼耐藥,而導致腫瘤繼續生長。因此對外泌體調控黑色素瘤的發病機制與達拉非尼耐藥的研究更突顯其意義。miRNA-23a 是存在脊椎動物的基因組中的一種抑癌因子,可參與基因轉錄后表達調控,從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲,其表達量在乳腺癌、小細胞性肺癌、肝細胞癌、膠質瘤等多種惡性腫瘤的診斷及預后評估中具有重要的參考價值。已報道miRNA-23a 在黑色素瘤中的轉移和復發中存在異常,而且已被證實可以通過外泌體分泌至腫瘤環境中,但其調節黑色素瘤進展的具體機制相關研究很少。

黑色素瘤耐藥研究中,細胞凋亡和自噬研究歷來是焦點和重點,其中細胞自噬可以降解細胞漿內的許多物質,比如細胞質、蛋白和一些大分子物質,將其傳遞到溶酶體,然后進行降解。

整個清除過程主要是為了細胞穩態得到保持,并使得細胞的氧化應激損傷得到保護,提高細胞的自噬活性關系到多種癌癥細胞的存活情況［7］。迄今為止,已經能夠支持靶向療法耐藥中,自噬占據重要地位的證據有很多［8］。凋亡作為程序性細胞死亡形式之一可以有序、有效的清除受損細胞,而癌癥的發生大部分與細胞凋亡機制失去平衡有著明顯的關系,凋亡不僅僅是腫瘤發生和發展的標志性事件,而且還與腫瘤對藥物的抵抗有著很大的關系［9］。LC3 合成前體LC3(pro-LC3),然后其末端被水解切割后失去多肽使得甘氨酸發生暴露,成為了LC3-Ⅰ。在細胞自噬的過程中,LC3-Ⅰ扮演著重要角色,其在ATG7、ATG12-ATG5-ATG16L 作用下結合磷脂酰乙醇胺組成了LC3-Ⅱ,其因為被修飾因此電荷發生變化而形成更快的遷移率。本研究選擇惡性黑色素瘤細胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達拉非尼對其進行24 h 處理,結果發現LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達拉非尼濃度的升高而增加；然后再用miR-23a 模擬物轉染對300 nM 的A375 細胞進行轉染,利用Western Blot 和qPCR 檢測轉染前后A375 細胞中的miR-23、LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達水平。發現轉染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的表達水平均高于轉染前,差異具有統計學意義 (P＜0.05)。Pearson 線性相關分析結果顯示,miR-23a 表達水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(P＜0.05),與ROS 無相關性(P＞0.05)。在細胞凋亡通路中,細胞內的Ca2+濃度升高后,氧化損傷會引起羥自由基等ROS、毒素、一氧化氮(NO)、生長因素和激素刺激等［3］發生異常改變,并會對caspase-8發生激活后引起caspase 級聯反應,從而細胞凋亡開始,因此本研究結果提示了miR-23a 表達水平與caspase通路相關,從而繼發了細胞凋亡通路,也可能是通過這一路徑,因為導致了黑色素瘤達拉非尼的耐藥發生。

綜上所述,達拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細胞A375,相比于處理前,其LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達顯著上調；達拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細胞中的miR-23a 表達水平上調后,能夠促使耐藥細胞發生自噬而導致凋亡加速,這可能就是miR-23a 在黑色素瘤達拉非尼耐藥中發生影響的可能機制。