擬南芥N末端乙酰轉移酶Naa50參與調控根細胞有絲分裂

馮金林，席曉宇，趙世鳳

(山西師范大學 生命科學學院，山西 太原 030031)

蛋白質N-末端乙酰化(N-terminal acylation，NTA)是廣泛存在于真核生物中的一種蛋白質修飾方式，絕大多數真核生物的胞質蛋白會發生N-末端乙酰化修飾，但是原核生物和古細菌中很少發生[1-2]。NTA是以乙酰輔酶A作為乙酰基團的供體，通過N-末端乙酰轉移酶(N-terminal acetyltransferase，NATs)的催化將乙酰基轉移到蛋白質N-末端的α-氨基上，主要以共翻譯方式進行乙酰化修飾，且這種修飾過程是不可逆的[3]。N-末端乙酰化修飾會影響多種蛋白質的功能。在分子水平上，蛋白質的N-末端乙酰化會影響蛋白質穩定性、抑制蛋白質轉位到內質網、促進蛋白質折疊，以及調節蛋白質-蛋白質相互作用等，是維持蛋白質動態平衡的重要方式[4-8]。在細胞水平上，N-末端乙酰化修飾會影響細胞增殖發育、細胞代謝、細胞凋亡等[9-11]。此外，NTA的失調會導致人Ogden綜合征、發育障礙和癌癥等多種病理情況的發生，也會觸發植物免疫和脅迫響應[12-13]。到目前為止，已經報道了8種不同的NATs，分別為NatA～NatH[12]，其在進化上都是保守的[8]。Nats由一個催化亞基和一個或兩個輔助亞基組成并且具有不同的底物特異性，可以參與調節細胞的生命活動[14-17]。

NatE復合物含有一個催化亞基Naa50，以及兩個輔助亞基Naa10和Naa15[18]。在人細胞中，Naa50傾向以起始甲硫氨酸保留、并且第二個氨基酸是Leu、Ile、Phe或Trp的底物蛋白進行乙酰化修飾[19]。人Naa50通過調控姐妹染色單體的分離過程，進而參與細胞分裂的調控[20]。果蠅Naa50/San蛋白缺失引起膜翅發育缺陷，Naa50通過調控黏連蛋白Scc1與黏附素亞單位Smc3的相互作用，建立或者維持姐妹染色單體的內聚力[21-23]。Naa50的缺失會降低人細胞系和果蠅細胞內姐妹染色單體的內聚力，導致細胞發生異常有絲分裂[21]。人Naa50基因在酵母中過表達會導致N末端乙酰化水平明顯增加，但是酵母Naa50基因過表達沒有表現出N末端乙酰化水平增加，且敲除酵母中的Naa50基因也未表現出明顯表型變化[19]。此外，Naa50對植物的生長發育也至關重要。在擬南芥中，Naa50參與調控植物免疫應答和逆境脅迫響應[24]。缺失Naa50會觸發植物的免疫防御調節機制，表現出嚴重的發育缺陷，以及誘導的脅迫反應[24]。在前期研究中發現，敲除擬南芥Naa50基因的植株對滲透脅迫表現出超敏反應[25]。naa50-1突變體主根的生長明顯受到抑制，相較于野生型表現出主根較短、根毛較早分化、細胞排列紊亂、細胞核大小不均一、幼苗嚴重矮化且高度不育的表型[25]。基于前期研究，猜測naa50-1突變體根短的現象可能是由于Naa50參與根尖細胞有絲分裂過程，進而調控根的正常生長。目前關于Naa50在植物生長發育方面的功能和作用機制研究較少。

H2B是組成核小體的組蛋白，分析H2B-YFP的熒光信號，可以反映不同分裂時期細胞中染色體的狀態。為了進一步探究Naa50在植物根生長發育過程中的作用，本文利用H2B-YFP株系，對naa50-1突變體根中細胞分裂情況進行分析；用PI染色分析naa50-1突變體的根細胞活力，還檢測了根細胞中CYCB1蛋白表達水平。研究結果進一步闡明了Naa50調控根生長發育的機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.]生態型為Columbia-0(Col-0)生態型，naa50-1突變體(CS350943)購自Arabidopsis Biological Resource Center。H2B-YFP植株、CYCB1-GUS植株為實驗室前期保存。植物培養基所用MS培養基基鹽購自北京中科起源科技有限公司，蔗糖購自天津市科密歐化學試劑有限公司，Phytagel、GUS染液和PI染液購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養

實驗用到的所有種子首先在4 ℃低溫下處理3 d，之后用75%乙醇消毒1 min，1.5%次氯酸消毒10 min，再點種于MS培養基，放入光照16 h(22 ℃)、黑暗8 h(18 ℃)的植物培養箱中培養7 d，然后將幼苗移栽到含有蛭石和營養液的土壤中，并移入光照16 h(22 ℃)、黑暗8 h(18 ℃)、相對濕度為65%的培養室中培養。

1.2.2 植物根尖細胞分裂情況觀察

將naa50-1突變體雜合植株與H2B-YFP植株開花后進行雜交，分別獲得野生型和naa50-1純合突變體背景下含H2B-YFP的穩定純合株系，將純合株系的種子在MS培養基上點種并培養6 d，在激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)下觀察幼苗根尖細胞分裂與野生型的差異。并統計有絲分裂率、染色體畸變率和微核千分率。

有絲分裂率(%)=(分裂細胞數/觀察的細胞總數)×100；

染色體畸變率(%)=(染色體畸變細胞數/觀察的細胞總數)×100；

微核率(%)=(微核細胞數/觀察的細胞總數)×100。

1.2.3 PI染色

將在MS豎直培養基生長5 d的野生型與naa50-1突變體幼苗置于載玻片上，滴加適量10 μg·mL-1的碘化丙啶染液(propidium iodide，PI)，染色50 s后，將幼苗用蒸餾水洗滌1次后置于新的載玻片上，將根尖置于載玻片中央，滴加25%甘油后蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余的甘油，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察根細胞標記的熒光信號。

1.2.4 GUS染色

將naa50-1突變體雜合植株與CYCB1-GUS植株開花后進行雜交，獲得naa50-1純合突變體背景下含CYCB1-GUS的穩定純合株系，將純合株系的種子在MS豎直培養基上培養5 d，然后將幼苗的根置于GUS染液中，在37 ℃恒溫培養箱中避光染色過夜。之后將幼苗用蒸餾水洗滌3次，置于載玻片上，將根尖移至中央并滴加適量水合氯醛(水合氯醛∶水∶甘油體積比為8∶3∶1)透明化處理4 h后，在熒光顯微鏡(Olympus DP71)下觀察根尖細胞有絲分裂活性。

1.3 數據統計

使用Microsoft Excel 2019軟件統計實驗數據。使用SPSS Statistics 17.0軟件中的Duncan法進行差異顯著性分析。所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 naa50突變體表型

利用H2B-YFP標記株系對Naa50在細胞分裂過程中的作用進行研究，通過觀察YFP熒光信號發現，野生型植株中的主根分生區細胞排列規則，細胞核呈規則球狀，大小相對均勻；而naa50-1突變體中主根分生區細胞排列無序，細胞核呈現出不同的形狀，大小不均等，存在較大或較小的細胞核(圖1)。細胞排列無序暗示Naa50的缺失可能造成細胞分裂方向改變，細胞核形態異常暗示Naa50的缺失可能影響了細胞分裂過程中遺傳物質的平均分配。

利用H2B-YFP對萌發5 d的擬南芥根尖細胞細胞核形態的觀察。標尺=20 μm。

2.2 naa50-1突變體有絲分裂過程中染色體分離異常

進一步通過H2B-YFP的熒光信號觀察野生型和naa50-1突變體中分裂期細胞的染色體分離行為。與野生型正常的細胞分裂過程中染色體分離行為相比，naa50-1突變體表現出異常的細胞分裂行為，包括微核、染色體橋、多束分裂、不等分裂、細胞板偏轉和雙核現象(圖2)。naa50-1突變體的染色體畸變率和分裂中期細胞的比例高于野生型(表1、表2)，表明在細胞分裂過程中Naa50對遺傳信息的平均分配起重要作用，同時促進細胞分裂從中期向后期轉變。

表1 Naa50對擬南芥根尖分生區細胞染色體畸變率的影響

表2 Naa50對擬南芥根尖分生區細胞有絲分裂率的影響

圖A、B、C、D分別為野生型細胞分裂的前期、中期、后期、末期；圖E、F、G、H為naa50-1突變體細胞分裂前期、中期、后期、末期；圖I為微核；圖J為染色體橋；圖K為多束分裂；圖L為不等分裂；圖M為細胞板偏轉；圖N為雙核現象。標尺=5 μm。

2.3 naa50突變體有絲分裂活性

為進一步探究Naa50在細胞分裂過程中的作用，利用細胞周期蛋白CYCB1-GUS標記株系對naa50-1突變體中的CYCB1蛋白表達豐度進行檢測。GUS信號的結果表明，相較于野生型，naa50-1突變體中CYCB1的蛋白豐度明顯增加(圖3-A)。這可能是由于naa50-1突變體中分裂中期細胞比例增加，進而促進細胞進入分裂期，是植物本身的一種反饋響應。

2.4 naa50突變體根細胞活性

細胞的異常分裂可能會導致遺傳信息無法平均分配到兩個子細胞中，造成產生非整倍體的子細胞。為了進一步探究非整倍體對植物細胞的影響，對野生型和naa50-1突變體的主根進行PI染色。PI主要對野生型根細胞的細胞壁進行著色，而在naa50-1突變體中，部分細胞內部也有紅色的PI染色信號，表明這些細胞已經死亡(圖3-B)。以上結果暗示naa50-1突變體中出現的死細胞可能是由于非整倍體細胞的基因組不穩定，導致細胞凋亡。

A，利用CYCB1-GUS對生長5 d的擬南芥根中CYCB1的表達量進行檢測；B，對生長5 d的擬南芥根尖進行PI染色；標尺=50 μm。

3 結論與討論

有絲分裂在細胞生長發育過程中發揮重要作用，是真核生物細胞分裂的基本方式。在有絲分裂期間，細胞骨架與膜結構重塑，紡錘體重新組裝，染色體被均勻地分配到兩個子細胞中[26]。正是由于多種細胞機制調控染色體的正確分離，才確保了物種之間穩定的遺傳特性[27]。異常的有絲分裂會造成染色體非整倍體的產生，導致染色體不能正常分離，使子代基因組信息不完整，甚至會影響個體的生長發育。

本研究結果表明，Naa50對擬南芥根尖細胞有絲分裂至關重要，缺失Naa50會導致根細胞散亂排列，細胞核呈現出大小不均等的現象，且表現出不同程度的細胞死亡現象。另外，naa50-1突變體相較于野生型有絲分裂率下降，染色體畸變率和微核率顯著增加，處在有絲分裂中期的細胞數多，細胞周期蛋白CYCB1的表達量明顯增加，說明Naa50能促進細胞有絲分裂從中期向后期轉移，并且促進細胞分裂過程中遺傳信息平均分配到兩個子細胞中。綜上所述，Naa50參與調控根細胞有絲分裂，在蛋白質共翻譯修飾水平上發揮作用進而影響植物的生長發育。

在真核生物中，NDE1(nuclear distribution protein nudE homolog 1)是動力蛋白Dynein的調節蛋白，敲除小鼠的Nde1基因，會造成其皮質神經前體細胞紡錘體組裝紊亂和有絲分裂延遲的現象；PLK1是一種在有絲分裂期高表達的絲蘇氨酸激酶，可以促進細胞有絲分裂和細胞骨架的形成，NDE1是PLK1的一種結合蛋白，兩者相互作用參與調節細胞有絲分裂[26]。植物分生組織(如根尖分生區、莖尖生長點等)中連續、規則的細胞依賴于有絲分裂增加其細胞數目，促進根的生長發育，保證植物從周圍土壤中吸收所需的營養成分[28-29]。擬南芥根分生組織細胞的染色體實時成像表明，有絲分裂的細胞中染色體和細胞骨架表現出高度的動態變化[29]。微管(microfllaments，MFs)和肌動蛋白微絲(actin microfilaments，AFs)是細胞骨架和細胞分裂所需的重要組成成分，分裂過程中早前期細胞分裂平面的選擇、染色體向兩極遷移和形成新細胞板都需要MFs和AFs的參與[29-31]。因此，MFs和AFs對細胞形態建成和細胞分裂至關重要，Naa50是否通過調控MFs和AFs而影響細胞有絲分裂也是未來非常值得關注的內容。