MC1R c.676A>G與山羊皮膚色素沉積的關系及其對黑色素合成的影響

蔣 婧，任航行，周 鵬，孫曉燕，李 杰，付 琳，張 麗，劉良佳，王高富，*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市山羊工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460)

黑色素是一種生物多聚體，廣泛存在于動植物和微生物中。動物的毛發、皮膚和眼睛的顏色均由黑色素的相對數量、性質和分布決定。色素合成涉及復雜的調控網絡。其中，黑色素的合成是由多個基因位點編碼產物共同調控的結果，現有研究已經揭示的主要有5大信號通路，其中，腺苷酸環化酶/cAMP信號通路在黑色素合成中起關鍵作用[1-4]。黑素皮質素受體1(MC1R)蛋白含有7個跨膜功能域，屬于G蛋白耦聯受體超家族。當MC1R分別與其天然配體——促黑素細胞激素(α-MSH)和拮抗劑——Agouti位點編碼蛋白(ASIP)結合時，可分別增加和減少胞內第二信使——環磷酸腺苷(cAMP)的水平，進而調節下游蛋白激酶A(PKA)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TYRP1)和多巴色素互變異構酶(DCT)等基因的表達和酶的活性，最終導致真黑素、褐黑素的合成[5-6]。一直以來，關于MC1R基因的研究主要集中在動物毛色上。研究發現，深色毛發的山羊[7-8]、水牛[9]、羊駝[10]和雞[11-12]皮膚中MC1R基因的表達均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于淺色毛發群體。大量研究表明，MC1R基因的多態性與動物毛色和人類頭發顏色變異相關[13-16]。然而，關于MC1R基因多態性與膚色變異相關性的研究報道，目前僅限于小鼠膚色[17]和人類膚色[18]、雀斑[19]、色痣[20]等方面。

酉州烏羊是迄今為止人們發現的唯一一種具有白毛烏皮表型的山羊品種，主要分布于武陵山區腹地的酉陽土家族苗族自治縣，其肉質細嫩，富含必需氨基酸、鮮味氨基酸，以及硒、鋅等微量元素[21]。除皮膚外，酉州烏羊的眼、鼻、嘴、角、肛門、陰門等處的可視黏膜也為烏色，其肉、骨可入藥，當地人稱之為“藥羊”[22]。酉州烏羊與渝東白山羊雜交的后代可出現烏、淺烏、部分烏、部分淺烏和不烏等5種膚色表型，其中，部分烏表型與人類皮膚黑變病的表型相似。酉州烏羊的皮膚與人類黑變后的皮膚在組織學上極為相似，均在真皮層內可見大量黑色素細胞和黑色素[23-24]。因此，酉州烏羊既是一個食藥兼用的家畜良種，又是研究人類多種黑變病的很好的自然突變模型。作者課題組前期研究發現，酉州烏羊皮膚組織的MC1R基因存在c.676A>G突變，導致226位的氨基酸殘基由賴氨酸變成谷氨酸(p.K226E)，該位點位于受光刺激和G蛋白配體結合的保守結構域上，會造成酉州烏羊MC1R蛋白空間構象的差異[25]。在前期研究的基礎上，本研究進一步分析MC1R基因c.676A>G突變與皮膚色素沉積的關系，檢測過表達MC1R基因野生型(MC1Rc.676A)和突變型(MC1Rc.676G)真核表達載體的各組細胞中MITF、TYR、TYRP1、DCT等基因相對表達量和黑色素含量的差異，探討MC1R基因c.676A>G突變對黑色素合成的影響，旨在為揭示MC1R基因在皮膚色素沉積方面的分子機制等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

實驗動物來源于重慶市酉州烏羊資源保護場。隨機選擇成年酉州烏羊17只(公羊3只，母羊14只)，及其與渝東白山羊雜交的后代成年羊103只(公羊51只，母羊52只)。所有羊只的皮膚表型包括烏、淺烏和不烏共3種。頸靜脈取血3～5 mL，裝入試管后放入保溫箱運回實驗室，-20 ℃保存備用。

小鼠皮膚黑色素瘤細胞(B16-F10)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。PCR擴增試劑盒[T5 Direct PCR Kit(Blood)]，購自北京擎科新業生物技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine?3000，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、Opti-MEM?Ⅰ減血清培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、馬血清(horse serum，HS)，均購自美國Gibco公司。青鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液，均購自新西蘭HyClone公司。反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)和實時熒光PCR擴增試劑盒[SYBR PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)]，均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。Trizol試劑，購自美國Invitrogen公司。

1.2 皮膚色度測定與血液PCR擴增

前期研究發現，烏色皮膚和不烏皮膚的黑色素含量和黑色素細胞數量有明顯差異[23]。由此可知，皮膚膚色是一個能有效反映體內黑色素含量的性狀。用剪毛剪剪掉酉州烏羊及其雜交后代的腹毛，用刀片刮干凈毛根后，應用色差儀(OPTO-STAR型肉色測定儀，德國Matthaus)測量皮膚色度值，每個個體重復測量3次。根據前期所得的酉州烏羊皮膚MC1R基因序列，設計PCR引物(表1的Goat-K-MC1R)，按照PCR擴增試劑盒說明書的要求和步驟擴增酉州烏羊及其雜交后代的MC1R基因。擴增體系如下：2×T5 Direct PCR Mix(Blood)15 μL，上、下游引物各1.2 μL，全血3 μL，Nuclease-Free Water 9.6 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產物經電泳檢測后送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

表1 實驗用引物的基本參數

1.3 質粒構建

使用化學合成法合成山羊MC1R基因野生型和突變型序列，將序列連接到GV230載體的多克隆位點上構建野生型重組質粒GV230-MC1R-A(c.676A)和突變型重組質粒GV230-MC1R-G(c.676G)，并通過酶切和基因測序2種方法進行鑒定。質粒構建過程委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成，對照質粒空載體GV230也購自該公司。

1.4 細胞培養與MC1R基因轉染

在無菌條件下，用含有10% FBS的RPMI 1640培養基復蘇B16-F10細胞，加入T25細胞培養瓶，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞生長達到90%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心，按照1.0×105mL-1鋪板于6孔細胞培養板中，24 h后更換新鮮培養基。待細胞生長達到70%～80%融合時，采用脂質體介導法瞬時轉染MC1R重組質粒入B16-F10細胞。實驗共設定4組：MC1R野生組，轉染重組質粒GV230-MC1R-A，即MC1Rc.676A過表達組，以下簡記為MC1R-A；MC1R突變組，轉染重組質粒GV230-MC1R-G，即MC1Rc.676G過表達組，以下簡記為MC1R-G；陰性對照組，轉染空載體質粒GV230，以下簡記為NC；空白對照組，不轉染質粒，以下簡記為BC。每組設置6個復孔。

轉染步驟簡述如下：除空白對照組外，每孔分別按照Opti-MEM?Ⅰ減血清培養基25 μL+轉染試劑5 μL和Opti-MEM?Ⅰ減血清培養基250 μL+質粒2.5 μg+轉染試劑5 μL配置混合液A和B，吹勻并瞬時離心，室溫靜置5 min后，將混合液A、B混合均勻，室溫靜置15 min，然后加入6孔細胞培養板中，與孔內的培養基混合均勻，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。含空白對照組的所有實驗組均棄培養基，用PBS緩沖液清洗后，更換分化培養基(含2% HS的DMEM培養基)繼續培養72 h，棄培養基，PBS緩沖液清洗2遍。其中：3孔加1 mL Trizol，待細胞全部裂解后，將混合液轉入1.5 mL EP管中，用于后續色素相關基因表達的檢測；剩余3孔，每孔加入500 μL 0.25%胰蛋白酶消化，消化終止后收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用于后續細胞黑色素含量的測定。

1.5 細胞黑色素含量測定

參照熊渺等[26]、趙益文等[27]的方法測定細胞黑色素含量，概述如下：在收集的每孔細胞中加入1 mL 1 mol·L-1NaOH，37 ℃孵育1 h，振蕩5 min。按每孔100 μL的規格加入非透明96孔酶標板中，每個樣品3個重復。在400 nm波長下，于Synergy H1型多功能酶標儀(美國BioTek公司)上檢測各實驗組的吸光值。黑色素含量采用相對值表示，即黑色素含量(合成率，%)=處理組的D400/對照組的D400×100。

1.6 色素相關基因檢測

將保存于Trizol中的細胞用Trizol法提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用LD2000A plus型超微量分光光度計(北京領宇科技有限公司)檢測RNA濃度和純度。將經檢測的提取完整的總RNA溶液稀釋至500 ng·μL-1，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成相應的cDNA。利用qRT-PCR(實時熒光定量PCR)方法檢測MC1R、MITF、TYR、TYRP1、DCT基因的mRNA表達情況。應用Primer Premier 5.0軟件設計各基因引物，除Goat-MC1R基因序列參考實驗室前期所得外，其他基因均參考NCBI數據庫中對應基因的序列設計，其中，Mouse-ACTB為內參基因。利用NCBI數據庫的blast功能檢測各對引物的特異性，引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。qRT-PCR反應體系(10 μL)如下：SYBR PremixExTaqTM5 μL，上、下游引物各0.2 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL，cDNA模板1 μL，RNase ddH2O 3.4 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。反應在ABI Stepone型熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)上進行。相對表達量的結果采用2-△△CT法進行計算。

1.7 數據統計與分析

利用Excel 2007軟件統計各種基因型在酉州烏羊及其雜交后代群體中的分布情況，計算遺傳純合度、雜合度、有效等位基因含量和多態信息含量，并檢驗群體內的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。

考慮性別、種群、基因型的效應，采用固定模型分析基因型效應對皮膚色度值的影響：

Yi，j，k=μi，j，k+Si+Bj+Gk+ei，j，k。

(1)

式(1)中：Yi，j，k為皮膚色度值，μi，j，k為群體均值，Si為性別效應，Bj為種群效應，Gk為基因型效應，ei，j，k為隨機誤差。運用SAS v9.4軟件包的PROC GLM過程分析性別、種群、基因型效應對皮膚色度值的影響，結果用平均值±標準誤的形式表示。

運用IBM SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析，對有顯著(P<0.05)差異的，用LSD法進行多重比較。利用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同基因型(基因)頻率的分布、遺傳特性及其與皮膚色度值的關聯

根據測序結果，分別計算酉州烏羊及其雜交后代2個群體的基因型頻率和等位基因頻率，以及相關遺傳特性指標(表2)。酉州烏羊及其雜交后代群體中，c.676A>G位點均以GG基因型占優勢。在酉州烏羊群體中，該位點的遺傳純合度為0.709，雜合度為0.291，有效等位基因數為1.410，χ2檢驗該位點在不同組合中的基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.01)，該位點的多肽信息含量為0.248，為低度多態[多態信息含量(PIC)<0.25]；在雜交后代群體中，該位點的遺傳純合度為0.751，雜合度為0.248，有效等位基因數為1.331，χ2檢驗該位點在不同組合中的基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.01)，該位點的多肽信息含量為0.217，為低度多態。

表2 酉州烏羊及其雜交后代MC1R基因c.676A>G位點的基因型(等位基因)頻率與遺傳特性

對120只酉州烏羊及其雜交后代群體中c.676A>G位點的基因型與相應個體的皮膚色度值進行關聯分析，結果顯示，性別效應對酉州烏羊及其雜交后代皮膚色度值的影響不顯著(P>0.05)，種群效應對皮膚色度值的影響極顯著(P<0.01)。據此，分別在酉州烏羊和雜交后代2個群體中就該位點的基因型與相應個體的皮膚色度值進行關聯分析。結果顯示，無論是在酉州烏羊群體中，還是在雜交后代群體中，不同基因型群體間皮膚色度值的差異均不顯著(表3)。

表3 MC1R基因c.676A>G位點多態性下酉州烏羊及其雜交后代的皮膚色度值

2.2 細胞形態與轉染結果

轉染前，MC1R野生組(MC1R-A)、MC1R突變組(MC1R-G)、陰性對照組(NC)和空白對照組(BC)的細胞數量、狀態差異不大；轉染24 h時，空白對照組的細胞數量明顯比其他3組增多；分化72 h后，各組細胞數量均有所減少，突觸增多、變長，細胞間的突觸相互交聯(圖1)。

A、B、C、D分別對應于空白對照組(BC)、陰性對照組(NC)、MC1R野生組(MC1R-A)和突變組(MC1R-G)細胞。1、2、3分別代表轉染前、轉染24 h和分化72 h。

無論是在轉染24 h，還是在分化72 h，空白對照組均未檢測到熒光，而陰性對照組、MC1R野生組和MC1R突變組均有較強的熒光信號，表明轉染成功，且陰性對照組的熒光信號最強(圖2)。

A、B、C、D分別對應于空白對照組(BC)、陰性對照組(NC)、MC1R野生組(MC1R-A)和突變組(MC1R-G)細胞。1、2分別表示轉染24 h和分化72 h。

檢測各組細胞中山羊MC1R基因的相對表達量(圖3)，結果顯示，MC1R野生組和MC1R突變組MC1R基因的相對表達量均極顯著高于陰性對照組，其中，MC1R野生組MC1R基因的相對表達量是陰性對照組的785倍，MC1R突變組MC1R

柱上無相同大寫字母的表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

基因的相對表達量是陰性對照組的2 322倍。上述結果證明，山羊MC1R基因被成功轉染進B16-F10細胞中。

2.3 細胞黑色素含量

檢測分化72 h各組細胞的黑色素含量(合成率)，結果顯示，MC1R突變組的黑色素含量最高，極顯著高于MC1R野生組和陰性對照組，而MC1R野生組的黑色素含量顯著高于陰性對照組(圖4)。這說明，轉染山羊MC1R基因對B16-F10細胞合成黑色素有促進作用，且MC1Rc.676A>G對黑色素合成的促進作用更大。

柱上無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 下游色素相關基因的表達情況

用實時熒光定量PCR法檢測腺苷酸環化酶/cAMP信號通路下游色素相關基因(MITF、TYR、TYRP1和DCT)的相對表達量(圖5)。結果顯示，MITF、TYR、TYRP1和DCT基因在各組細胞中的表達趨勢一致，均在MC1R突變組最高，且極顯著高于陰性對照組。除TYR基因在MC1R突變組細胞中的相對表達量僅顯著高于MC1R野生組外，其余基因的相對表達量均為MC1R突變組極顯著高于MC1R野生組。MC1R野生組細胞中的MITF基因和DCT基因的相對表達量顯著高于陰性對照組，TYR基因和TYRP1基因的相對表達量極顯著高于陰性對照組。這說明，MC1R基因能促進下游通路中直接影響黑色素合成的相關基因的表達，且突變型的促進作用更大。

圖5 各組細胞色素相關基因的表達水平

3 討論

膚色與肉色均屬于胴體外觀性狀。對膚色或肉色的評價，較常用的方法有3種——肉眼觀察法、比色卡(或肉色板)比對法和色差儀測定法[28-30]。無論是肉眼觀察法還是比色卡比對法，均受主觀因素影響較大。光學色差儀可將原始的國際照明委員會(CIE)規定的刺激值通過數學關系轉換成易于理解的顏色數值，具有數據準確性高、客觀性強、操作方便等優點[31]，現已成功應用于豬肉肉色評定[32]、山羊肉色評定[33]、矮腳黃雞皮膚色度值評定[31]、鴨肉皮膚色澤[34]等研究中。本研究選用光學色差儀(OPTO-STAR型肉色測定儀)測量山羊皮膚膚色，測量數值與肉眼觀察結果一致，色度值越大，肉眼觀察到的皮膚顏色更烏。這說明光學色差儀能夠準確地反映動物皮膚膚色的烏度，與前人研究結果一致[31，35]。

在實際生產中我們發現，酉州烏羊羔羊的皮膚色度一般比成年羊淺，這與略陽烏雞膚色值隨周齡增長的變化趨勢一致[36]。酉州烏羊與渝東白山羊的雜交后代中，會出現烏、淺烏、不烏、部分烏和部分淺烏5種表型，除了部分烏和部分淺烏2種表型外，其他個體腹部的皮膚色度與其他部位肉眼觀察無差異。為了避免年齡和表型的影響，本研究選擇皮膚為烏、淺烏或不烏表型的成年羊為研究對象，選擇更方便操作的腹部作為測量部位，深入分析性別、種群、基因型效應對皮膚色度值的影響，結果發現，種群效應對皮膚色度值的影響極顯著，即酉州烏羊群體的皮膚色度值極顯著高于其雜交后代，而性別效應的差異不顯著。這一結果說明，山羊皮膚色度受到種群的影響，而不受性別的影響，與前人在雞上的研究結果一致[36]。

MC1R基因是黑色素合成重要通路之一的腺苷酸環化酶/cAMP信號通路中的關鍵成員，通過與α-MSH或ASIP結合，調節下游MITF、TYR、TYRP1和DCT等基因的表達和酶的活性，從而調控黑色素合成[3]。MC1R蛋白被證明具有較高的組成性活性，即在沒有激動劑和拮抗劑的情況下，MC1R的組成性活性足以支持小鼠產生黑色素[37]。有研究報道，抑制B16細胞中MC1R基因的表達，其下游TYR基因的表達量下降，黑色素含量隨之降低[38]。本實驗轉染山羊MC1R基因重組質粒到B16-F10細胞中過表達，結果發現，黑色素含量和下游MITF、TYR、TYRP1和DCT基因的相對表達量均極顯著或顯著高于陰性對照組，與前人研究結果相符，說明山羊MC1R基因能在B16細胞中正常表達，且對通路下游基因的表達和黑色素合成均有促進作用。

作者課題組前期在酉州烏羊群體中發現，c.676A>G(p.K226E)，與合川白山羊、巫溪白山羊、酉陽本地白山羊共享，該位點位于受光刺激和G蛋白配體結合的保守結構域上，會導致酉州烏羊MC1R蛋白空間構象差異[25]。研究發現，用丙氨酸替代MC1R蛋白p.226K會導致信號幾乎完全喪失，表明p.226K對于MC1R耦聯刺激G蛋白是必不可少的[39]。后來的研究發現，可能由于引入的殘基性質不同，自然發生的p.K226E突變具有正常的配體結合和次級cAMP信號轉導[37]。本研究轉染野生型(MC1Rc.676A)和突變型(MC1Rc.676G)真核表達載體到B16-F10細胞中過表達，發現無論是黑色素含量，還是cAMP信號通路下游色素相關基因的表達，MC1R突變組均極顯著或顯著高于野生組，說明MC1R基因c.676G能促進黑色素細胞合成黑色素，且這一過程可能是通過調節下游MITF、TYR、TYRP1和DCT等基因的表達來完成的。

Wu等[40]研究發現，MC1Rc.676A>G突變在大部分被調查動物(以全白為主)中，GG基因型頻率較高，而波爾山羊(紅頭白山羊)的c.676A>G突變為AA基因型。Javanmard等[41]發現，AA基因型在深色毛色山羊品種中頻率較高。本研究發現，酉州烏羊及其雜交后代群體中均以GG基因型為主，這可能跟它們的被毛顏色為白色有關。毛發的色素沉積機制與皮膚色素沉積機制存在較大差異：毛發中的色素是由毛囊中的黑色素細胞產生的，毛色只受黑色素含量的影響，但膚色受黑色素含量和黑色素細胞數量的共同影響[17]。真黑素和褐黑素在毛囊中的合成是反向耦合的，即當一個上升時，另一個下降；但在皮膚中，真黑素和褐黑素不存在這樣的反向耦合關系[17]。皮膚中的黑素皮質素信號通路并不像在毛囊中那樣，將真黑素和褐黑素的合成結合起來，即使是通過共享的信號通路，頭發和皮膚的黑色素細胞也受到相對獨立的調控，因此MC1R對皮膚和毛發顏色的調控機制是不一樣的[17]。相較于毛發的色素沉積，皮膚的色素沉積過程更為復雜，且膚色和毛色的調控機制相對獨立。這可能正是導致酉州烏羊被毛為白色但皮膚是烏色的主要原因。

黑色素的合成受多條信號通路的調控，不同信號通路之間發生交叉調控，形成復雜的調控網絡[42]。MC1R基因可與其拮抗劑ASIP基因互作來調控皮膚色素的沉積。Ren等[43]對不同膚色山羊的100 d 胎兒皮膚在轉錄組水平進行差異表達基因分析，發現ASIP-MC1R的相互作用可能在山羊胎兒皮膚色素沉積中發揮重要作用。Steiner等[44]研究發現，MC1R和ASIP共同負責大多數沙灘鼠亞種之間的色素沉著差異，MC1R編碼區的衍生突變和ASIP基因mRNA的表達增加，均有助于淺色色素沉積。Hepp等[45]在對巴西克里奧爾羊品種進行研究時發現，MC1R和ASIP基因型的上位互作是導致顏色發生顯著變化的原因。Van Raamsdonk等[17]發現，Agouti和MC1R野生型小鼠的毛發經歷了一種叫作色素類型轉換的現象，當每根頭發開始生長時，它就會被染成真黑素，在頭發生長的中途，有一段短暫的Agouti表達，會暫時阻止MC1R信號，并將真黑素的生產轉換為褐黑素，由此導致黑色頭發中間產生一圈黃色。本研究發現，MC1Rc.676A>G突變野生型在小鼠B16-F10細胞中能促進黑色素的合成，但該突變在酉州烏羊及其雜交后代中與膚色色度的變化無顯著關聯。這可能是因為，在山羊皮膚中，MC1R基因調控的黑色素合成會受到其拮抗劑ASIP基因的調控。

綜上所述，MC1R基因c.676A>G在酉州烏羊及其雜交后代中以GG基因型為主，各基因型群體中皮膚色度值差異不顯著，說明c.676A>G不直接影響山羊皮膚色素沉積。山羊MC1R基因能在B16-F10細胞中正常表達，且能促進B16-F10細胞中cAMP信號通路下游色素相關基因(MITF、TYR、TYRP1和DCT)的表達，以及黑色素的合成，且突變型(MC1Rc.676G)的促進作用比野生型(MC1Rc.676A)更大，說明MC1Rc.676A>G與黑色素合成密切相關。MC1R基因c.676A>G能直接影響B16-F10細胞中cAMP信號通路下游色素相關基因表達和黑色素合成，但不直接影響山羊膚色的變異，其具體原因還有待進一步研究。