T7噬菌體尾絲蛋白隨機進化文庫的構建

洪偉鳴，李睿婷，郭子杰，徐 海，左偉勇，張 亮，宋 亮

(江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300)

噬菌體是一類寄生在原核生物，如細菌、真菌、放線菌或螺旋體等宿主細胞內的病毒，在發現之初就被用于細菌感染性疾病的治療[1]。隨著人類進入抗生素時代，噬菌體治療逐漸淡出公眾的視野。近年來由于抗生素的濫用，導致耐藥菌的不斷出現，細菌的耐藥性已然成為全球范圍內的公共衛生問題，噬菌體作為細菌的天然殺手再次受到關注[2-3]。

噬菌體對其宿主的識別具有嚴格的特異性，不同種、甚至不同分離株常常表現出差異較大的噬菌體敏感性[4]。宿主譜較窄已然成為限制噬菌體抗菌發展與運用的主要障礙之一。雞尾酒療法和廣譜噬菌體分離被認為是克服這一障礙最為經濟有效的途徑。將不同宿主識別譜的噬菌體配伍成混合制劑即為雞尾酒療法，格魯吉亞的Eliava噬菌體治療中心已成功運用該方法數十年[5-6]。但該方法也存在一定的被動性，Eliava中心需定期更新雞尾酒制劑的噬菌體構成，以保證治療針對性與有效性。隨著分子生物學技術、基因編輯以及各種生物組學的快速發展，人們對噬菌體的認知已經超出形態學觀察及生理生化活性鑒定的范疇，逐步從被動篩選自然突變株噬菌體，向主動改造或創造新噬菌體轉變。其中，CRISPR-Cas[6]、Bacteriophage recombinant of electroporated DNA(BRED)[7]等技術正在被廣泛地用于噬菌體改造。Scholl等[8]通過基因改造使T7噬菌體能夠表達一種唾液酸酶，利用該酶消化大腸桿菌產生的K1莢膜，進而拓展了T7噬菌體宿主譜。樂率[9]將PaP1噬菌體的尾絲蛋白替換成JG004噬菌體對應蛋白，使得新構建的PaP1噬菌體獲得感染JG004宿主的能力，但喪失對原有宿主的裂解性。T4噬菌體感染大腸埃希菌以及親緣關系近的志賀氏菌，Tétart等[10]將噬菌體SV76.3和Mi基因組成的片段置換T4噬菌體尾絲基因的同源結構，構建的雜合噬菌體不僅能識別天然宿主，也能夠識別假結核耶爾森菌。

T7噬菌體是侵染大腸埃希菌的小型烈性噬菌體，其病毒顆粒有二十面體頭部和非常小的尾，二者之間由頭尾頸圈連接。T7噬菌體gp17基因編碼533氨基酸的尾絲蛋白(p17)，每個噬菌體含有6條尾絲蛋白(圖1-A)，為同源三聚體結構，主要負責識別宿主、啟動感染。決定T7噬菌體宿主識別的區域位于最末端的球狀區，結構學解析表明，該區域有4個暴露的柔性loop環(BC-、DE-、FG-和HI-loop)(圖1-B)，該區域氨基酸組成的改變導致宿主識別譜的變化，是主要的宿主識別區域[11]。易錯PCR(error-prone PCR，EP-PCR)通過改變常規PCR的擴增條件來調整反應過程中的錯配頻率，進而獲得隨機突變的DNA群體，其操作簡便，特別適用于構建較小基因片段的突變文庫。本研究利用EP-PCR技術對T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因序列進行隨機突變，拯救T7噬菌體尾絲蛋白隨機進化文庫，為后續篩選相對廣譜噬菌體或者特定病原菌噬菌體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

噬菌體與質粒：T7 Select 415-1b噬菌體(GenBank accession number V01146噬菌體為骨架改造)拯救試劑盒購于Merck公司，pMD19-T simple載體購于寶生物公司。

主要試劑：限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit均為寶生物公司產品；膠回收試劑盒為QIAGEN公司產品；其余試劑均為分析純。

主要儀器：臺式離心機購自美國Beck-man公司；BTX電轉化儀、PCR儀購自寶生物公司；Geldoc-It Imaging System購自美國UVP公司。

1.2 T7噬菌體基因組提取與酶切

采用苯酚-氯仿抽提的方法提取T7噬菌體基因組[12]，100 mL T7噬菌體培養液8 000 r·min-1離心15 min，去除裂解細菌的碎片，收集上清液。加入終濃度為1 μg·mL-1的RNase A、DNaseⅠ，37 ℃反應1 h，以1∶4體積比加入PEG-NaCl溶液(20%PEG-8000，2.5 mol·L-1NaCl)，搖勻溶解后，放置4 ℃過夜。次日，12 000 r·min-1離心30 min并收集沉淀。用5 mL SM緩沖溶液重懸沉淀，加入50 μL 10%SDS、50 μL 0.5 mol·L-1EDTA，于60 ℃消化30 min。加入等體積的DNA提取液(苯酚/氯仿/異戊醇體積比 25∶24∶1)，抽提2次，轉移上清液，加入等體積的乙醇混勻，-20 ℃放置1 h，12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀并用1 mL預冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀于室溫下自然晾干，然后溶于100 μL TE溶液，即為提取的T7噬菌體DNA。取10 μL基因組經SfiⅠ單酶切，0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收約33 kb片段。

1.3 常規PCR擴增

以T7噬菌體基因組為模板：用引物F1/R1擴增尾絲蛋白羧基末端(Tail fiber carboxy-terminal，TF-ct)33 308～33 663位約350 bp基因序列。反應程序為：94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，30個循環。在F1引物5′端引入SfiⅠ酶切位點，R1引物5′端引入SphⅠ酶切位點。用引物F2/R2擴增基因組33 663～37 314位約4 000 bp基因序列。反應程序為：94 ℃ 30 s；52 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min，30個循壞，并在F2引物5′端引入SphⅠ酶切位點。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，SphⅠ單酶切4 000 bp片段，切膠回收，-20 ℃保存備用。引物序列見表1。

表1 文庫構建及鑒定引物

1.4 易錯PCR擴增

以回收的TF-ct基因片段為模板，用F1/R1引物進行EP-PCR擴增。反應體系為50 μL，其中包含模板(1 ng·μL-1，1 μL)、引物(10 μmol·L-1，1 μL)和TITANIUMTaq酶(1 μL)；比較3種緩沖條件(buffer condition，BC)下擴增效率和突變率的差異：BC9(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，4 μL、2 mmol·L-1dGTP，5 μL)、BC6(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，4 μL、2 mmol·L-1dGTP，2 μL)、BC3(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，2 μL、2 mmol·L-1dGTP，1 μL)。EP-PCR反應條件：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性 30 s，68 ℃退火延伸1 min，25個循環。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定EP-PCR擴增產物，并切膠回收。

1.5 質粒文庫的構建

將突變的TF-ct基因以3∶1的物質的量之比與pMD19-T simple連接，轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞。轉化產物涂布在含有Amp+/IPTG/X-gal LB固體培養基的培養皿上，37 ℃過夜。統計菌落總數和藍色菌落數，計算質粒文庫的容量和重組率[13]。質粒庫容量=菌落總數×轉化產物量；重組率(%)=(菌落總數-藍色菌落數)/菌落總數×100。剔除藍色菌落，收集培養皿中所有菌落，LB液體培養基重懸菌落，提取質粒經SfiⅠ、SphⅠ雙酶切鑒定，回收350 bp目的片段。

1.6 噬菌體文庫的構建

將SfiⅠ單酶切回收的33 kb基因組片段、SfiⅠ和SphⅠ雙酶切回收的隨機突變TF-ct片段以及SphⅠ單酶切回收的4 000 bp片段以1∶1∶1的物質的量之比進行連接(圖1-C)。取5 μL連接產物與25 μL包裝蛋白混合，25 ℃反應2 h，反應體系中加入270 μL LB液體培養基終止反應，即為拯救的噬菌體文庫[13]。取5 μL包裝產物10倍梯度稀釋并與200 μL過夜培養的T7噬菌體宿主細菌BL21混合，經雙層瓊脂夾心法測定噬菌體滴度；挑取單噬斑，用引物F1/R1進行PCR檢測目的基因插入情況。每組隨機挑選5個噬斑PCR陽性產物進行序列測定，采用DNAStar序列分析軟件對測序結果進行比對分析。分別統計目的基因中突變的堿基數及對應的氨基酸突變數，按照突變率(%)=突變堿基數(個)/目的基因大小(bp)×100計算突變率。將剩余的295 μL包裝產物轉接100 mL對數生長期BL21，37 ℃搖床培養3 h至宿主細菌完全裂解，PEG-NaCl沉淀法回收噬菌體，即為構建的T7噬菌體尾絲蛋白隨機進化文庫。

圖1 定向進化文庫構建原理及流程

1.7 單克隆噬菌體吸附力比較

從已測序的15個單克隆噬菌體中隨機挑選EP3、EP6、EP10、EP12和EP13這5個在loop區域有點突變的克隆進行純培養，用于比較宿主吸附能力的差異。將宿主細菌BL21培養至對數生長期，并在預熱的LB培養基稀釋至1×107CFU·mL-1。以5 mL每管分裝BL21細菌，往其中分別接種單克隆噬菌體至濃度為1×105PFU·mL-1，并于37 ℃繼續孵育5 min。取200 μL孵育混合物立即離心分離游離噬菌體和吸附在BL21表面的噬菌體；另取200 μL孵育混合物不做離心處理。分別測定離心后上清中游離噬菌體的滴度(Nf)和未離心處理混合物中的噬菌體滴度(Nt)。計算噬菌體吸附率α=-0.2[ln(Nf/Nt)][14]。

2 結果與分析

2.1 基因片段的制備

從T7噬菌體培養液中成功提取到高純度T7噬菌體基因，電泳顯示基因組條帶單一、大小符合預期；經SfiⅠ單酶切可將線性T7噬菌體基因組分成約33 kb左側片段以及約4 000 bp右側片段(圖2-A)。以提取的基因組為模板，F1/R1引物擴增出350 bp的T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因片段(圖2-B)，F2/R2引物擴增出尾絲蛋白基因下游約4 000 bp基因片段(圖2-C)。

A：T7噬菌體基因組提取及酶切；M，DL15000 DNA marker；1，T7噬菌體基因組；2，SfiⅠ單酶切T7噬菌體基因組。B：PCR擴增T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因片段；M，DL2000 DNA marker；1，TF-ct基因片段。C：PCR擴增T7噬菌體尾絲蛋白下游末端基因片段；M，DL5000 DNA marker；1，尾絲蛋白下游末端基因片段。

2.2 TF-ct基因片段的隨機突變及質粒文庫構建

為了有效擴增TF-ct基因片段同時保證獲得足夠的突變率，根據突變試劑盒使用說明，選擇3個緩沖條件進行EP-PCR擴增。隨著擴增體系中Mn2+、dGTP含量的逐漸下降，從圖3-A可以看出，目的條帶的亮度逐漸升高，說明下調擴增體系中Mn2+及dGTP的含量有助于提高擴增效率。分別回收3個緩沖條件下擴增的TF-ct基因片段，與pMD19-T simple載體連接，轉化DH5α感受態細胞，構建質粒文庫。提取文庫質粒，經SfiⅠ和SphⅠ雙酶切，獲得與預計大小相符的目的條帶(圖3-B)，說明質粒文庫構建成功。重復構建質粒文庫3次，其庫容分別為1.25×107、2.33×107、3.46×107CFU·mL-1，通過統計藍白斑比率發現3個質粒文庫的重組率均高達90%以上。

A：EP-PCR擴增TF-ct 基因片段；M，DL5000 DNA marker；1～3，BC9、BC6和BC3緩沖條件下擴增TF-ct基因片段。B：雙酶切鑒定質粒文庫；M，DL5000 DNA marker；1～3，BC9、BC6和BC3質粒文庫雙酶切鑒定。

回收SfiⅠ和SphⅠ雙酶切條帶，用于T7噬菌體尾絲蛋白定向進化文庫的構建。

2.3 隨機進化文庫的構建及鑒定

按照圖1-C中的構建流程，將33 kb的T7噬菌體基因左側片段、3個質粒文庫中回收的TF-ct片段以及尾絲蛋白下游至基因右側的片段，以等物質的量之比進行連接，通過包裝蛋白包裝拯救T7噬菌體尾絲蛋白隨機進化文庫。測定BC9、BC6和BC3噬菌體文庫的滴度分別為1.37×107、5.52×107和8.26×107CFU·mL-1，并隨機挑選5個噬斑進行PCR鑒定，從圖4-A可以看出，TF-ct基因均成功插入到設計位點。對15個PCR產物進行序列測定，通過與原始序列相比對發現(圖4-B)，隨機挑選的15個克隆均有隨機突變位點，突變率高達100%。

A:單克隆噬菌體PCR鑒定；M，DL2000 DNA marker; 1～5，BC9噬菌體文庫；6～10，BC6噬菌體文庫；11～15，BC3噬菌體文庫T7噬菌體基因組。B：氨基酸序列分析；15個測序樣品的氨基酸序列各需相同，且在對應的4個loop區域均有氨基酸點突變。

2.4 不同緩沖條件下突變率的分析

本研究選擇BC9、BC6和BC3三個緩沖條件，并依次降低體系中Mn2+和dGTP濃度，從表2可以看出：隨著Mn2+和dGTP濃度的降低，其平均堿基突變數及對應氨基酸突變數均同步下降。

表2 不同BC條件下EP-PCR的突變率統計

2.5 尾絲蛋白突變對吸附能力的影響

分析已測序噬菌體單克隆TF-ct氨基酸序列，挑選EP-4(I 517K)、EP-6(K 498 T)、EP-10(S 477 I)、EP-12(K 498 R)和EP-13(G 476 A)5個在loop區域有點突變的單克隆進行純培養。通過測定突變株T7噬菌體吸附大腸埃希菌宿主能力，評價尾絲蛋白羧基末端loop區域氨基酸突變對T7噬菌體生物學功能的影響。以T7-wt作為對照，比較吸附能力，從圖5可以看出，EP-6、EP-12對應于DE loop的突變降低了噬菌體與宿主的吸附能力，而EP-10、EP-13對應于BC loop的突變，僅EP-13提高了噬菌體與宿主的吸附能力。

以T7-wt標準株為參照，比較5株尾絲蛋白點突變T7噬菌體吸附宿主大腸埃希菌的效率差異，相同字母標記表示差異不顯著，不同字母標記表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

自然進化往往是隨機的過程，而實現進化的兩個前提是突變與篩選。定向進化則是人為設定標準的選擇，很早就被運用于動植物的育種篩選。針對特定蛋白分子的體外定向進化，又被稱為實驗分子進化，無需事先了解蛋白的空間結構和作用機制，幾乎適用于任何蛋白質的分子改造和篩選，這為研究蛋白質的結構和功能提供了一種更為方便、快捷的途徑。定向進化的成功實現，需要滿足3個方面的條件：合理的進化策略、合適的表達系統以及高通量篩選方法[15]。

在分子生物學飛速發展的今天，定向進化的先驅們建立了許多經典的進化策略和技術，例如Leung團隊建立的EP-PCR技術[16]、Willem教授建立的DNA Shuffling[17]技術以及Miguel Alcalde開發的MORPHING[18]技術等，為定向進化研究提供了技術保證。其中，EP-PCR技術是在常規PCR基礎上演化而來的，是在擴增過程中引入錯誤配對，使得擴增產物出現數量眾多的點突變，是一種體外誘導DNA序列突變的高效方法。擴增過程中DNA聚合酶保真性、4種dNTP比例、Mg2+離子濃度、Mn2+離子濃度、模板濃度等都是影響錯配率的關鍵因素，優化EP-PCR條件可以確保獲得隨機度更高的擴增產物。本研究中通過采用3種不同濃度的Mn2+、dGTP進行EP-PCR擴增，獲得3個不同突變率的目的片段，從而使尾絲蛋白羧基末端的突變子覆蓋最適合的范圍，提高了后期文庫篩選的得率。

從自然界中篩選相對廣譜的噬菌體是一項長期且艱巨的工作，而噬菌體宿主識別譜較窄的特性更是給這項工作增加了難度[19]。T7噬菌體通過尾絲蛋白與宿主細菌表面LPS相作用，每條尾絲獨立結合LPS能力很弱且可逆，這樣使得T7噬菌體能沿著細菌表面滑動；只有當多條尾絲和LPS相互作用后才能使噬菌體在細菌表面穩定定植，此時基盤正對細菌外膜，這種初步吸附使信號從噬菌體底部傳遞到頭部，從而啟動感染的不可逆步驟。決定T7噬菌體宿主識別的區域位于尾絲蛋白最末端的第4個球狀區，結構學解析表明，該區域有4個暴露的柔性loop環，是主要的宿主識別區域。Heineman等[20]發現T7噬菌體p17蛋白在FGloop的Asp520突變成Glu和HI-loop的Val544突變成Ala，使其喪失與宿主E.coliB和E.coliK2的結合能力，說明該區域的氨基酸組成對宿主的選擇識別至關重要，氨基酸的突變導致其宿主識別的改變。本研究中挑選5個loop區域發生點突變的克隆進行宿主吸附能力的差異比較，發現在DE loop的K498T和K498R突變能夠降低T7噬菌體與宿主的吸附能力，而位于BC loop的G476A突變能夠提高T7噬菌體與宿主的吸附能力，該發現再次驗證了T7噬菌體尾絲蛋白loop區域與宿主識別的相關性。

受到實驗室生物材料積累的限制，尚未針對臨床細菌樣品尤其是畜禽致病性大腸埃希菌開展相對廣譜的T7噬菌體篩選。但本研究構建的T7噬菌體尾絲蛋白隨機進化文庫為后續篩選工作奠定了良好的基礎。