菜用大豆炭疽病病原菌的分離鑒定與防治

劉 娜，范翹楚，周 佳，宋雅靜，張古文，馮志娟，卜遠(yuǎn)鵬，王 斌，龔亞明

(農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

菜用大豆，又稱鮮食大豆，俗稱毛豆，指在豆莢呈綠色、籽粒尚未達(dá)到完全成熟、生理上處于鼓粒盛期采收用作蔬菜食用的大豆，是一種重要的傳統(tǒng)豆類蔬菜[1-4]。菜用大豆因口感好且營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。隨著人們飲食觀念的更新，健康意識(shí)的不斷增強(qiáng)，菜用大豆又被作為一種健康食品和保健蔬菜，愈加受到大眾喜愛，市場(chǎng)前景十分廣闊。目前，我國(guó)菜用大豆年種植面積40萬(wàn)hm2左右，總產(chǎn)量超過400萬(wàn)t，年產(chǎn)值約100億元，是世界上最大的菜用大豆生產(chǎn)國(guó)和速凍加工出口國(guó)。在我國(guó)東南沿海各省，菜用大豆是農(nóng)業(yè)出口創(chuàng)匯的重要新興產(chǎn)業(yè)。浙江省由于獨(dú)特的氣候優(yōu)勢(shì)和區(qū)位優(yōu)勢(shì)，成為優(yōu)質(zhì)菜用大豆生產(chǎn)的主要區(qū)域。近年來，浙江省菜用大豆年種植面積在8萬(wàn)hm2左右，年產(chǎn)值20億元以上，產(chǎn)業(yè)規(guī)模穩(wěn)居全國(guó)首位。菜用大豆產(chǎn)業(yè)已成為目前我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)，亦是搶占國(guó)際大豆產(chǎn)業(yè)制高點(diǎn)的新突破口。近年來，隨著菜用大豆產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、區(qū)域化、集約化生產(chǎn)體系形成，突顯了一系列問題，制約了產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，主要表現(xiàn)在主栽品種單一、老化、復(fù)種指數(shù)高和輪作困難，菜用大豆生產(chǎn)中各種病害威脅日益嚴(yán)重，特別是炭疽病，破壞力強(qiáng)，發(fā)病時(shí)在豆莢表面形成黑色斑點(diǎn)，嚴(yán)重影響鮮莢外觀商品性和品質(zhì)，已成為我國(guó)菜用大豆生產(chǎn)面臨的主要問題之一，危害巨大[5-6]。

植物炭疽病是世界性病害之一，主要由炭疽病屬(Colletotrichum)真菌引起，可侵染植物的所有部位，尤其是地上部位。菜用大豆炭疽病在整個(gè)生育期都可發(fā)生，尤其是在結(jié)莢至釆收期發(fā)生最為嚴(yán)重，致其產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。在高溫高濕條件下病菌生長(zhǎng)迅速，隨著豆莢的長(zhǎng)大，病斑會(huì)慢慢地?cái)U(kuò)大，最終呈條狀或不規(guī)則形狀，病斑的顏色由褐色變?yōu)辄S褐色或紅銹色，與銹狀斑極為相似，因此在許多地方被誤認(rèn)為是菜用大豆銹病[5]。據(jù)前人報(bào)道，引起菜用大豆炭疽病的病原菌主要有平頭炭疽菌(Colletotrichumtruncatum)、毀滅炭疽菌(C.destructivum)、毛核炭疽菌(C.coccodes)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)及禾谷炭疽菌(C.graminicola)等[7-9]?？梢娨鸩擞么蠖固烤也〉牟≡N類較多且復(fù)雜，準(zhǔn)確鑒定病原菌種類對(duì)于致害機(jī)制研究及精準(zhǔn)防控極為重要。炭疽病防治非常困難，生產(chǎn)上存在濫用化學(xué)農(nóng)藥、病原菌出現(xiàn)嚴(yán)重的抗藥性、環(huán)境污染等一系列問題[10-11]。本文以浙江省內(nèi)發(fā)現(xiàn)的炭疽病病株為材料，進(jìn)行病原菌的分離、純化、形態(tài)學(xué)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定，以明確病原真菌的種類，并測(cè)定了多菌靈和戊唑醇的化學(xué)防治效果，為生產(chǎn)上防治菜用大豆炭疽病的科學(xué)用藥提供重要指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集、病原菌的分離與純化

菜用大豆病株采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧楊渡科研創(chuàng)新基地，共采集10份樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱備用。采用組織分離法分離病原菌，將疑似菜用大豆炭疽病的新鮮發(fā)病組織清洗干凈，用解剖刀從病健交界處分出0.5 cm×0.5 cm的數(shù)塊小塊。依次用70%乙醇浸泡10 s、4%次氯酸鈉溶液浸泡6 min、滅菌水漂洗3次后，將發(fā)病組織表面水分用吸水紙吸干，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，根據(jù)形成的菌落特征初步判定病菌的種類。查閱相關(guān)資料對(duì)比菌落的形態(tài)特征，將疑似炭疽菌的菌落用解剖刀劃出0.5 cm×0.5 cm的菌塊，然后接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。純化好的病菌接種PDA斜面培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)后，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌菌絲體的培養(yǎng)

把保存的菌株接種在PDA平板上，放在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每天觀察菌落形態(tài)以及顏色特征。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定

依據(jù)柯赫氏法則對(duì)分離得到的純培養(yǎng)物進(jìn)行致病性檢測(cè)。選取健康的菜用大豆葉片，用大量的無(wú)菌水清洗后置于鋪有吸水紙的保鮮盒內(nèi)，用無(wú)菌刀片切取菌碟(5 mm×5 mm)，菌絲面朝下，接種到葉片上，重復(fù)3次，空白對(duì)照為無(wú)菌PDA菌碟，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 病原菌菌絲DNA的提取

用滅菌刀片從PDA培養(yǎng)基上收集足夠量的菌絲體，放到研缽里，加入適量的液氮進(jìn)行充分研磨后，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定后，將DNA保存至-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.4 PCR反應(yīng)

以DNA為模板，PCR擴(kuò)增所用到的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)的總體積設(shè)置為50 μL，具體包括2×TaqPCR MasterMix 25 μL、模板DNA 1 μL、引物ITS1和ITS4各2 μL、ddH2O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從NCBI中選取幾個(gè)不同種類的炭疽病菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法采用鄰接法(neighbor-joining)，自舉檢測(cè)(bootstarp)1 000次。

1.3 不同殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

1.3.1 菌株的準(zhǔn)備

PDA培養(yǎng)平板上接入已活化的待測(cè)菌株，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，用內(nèi)徑5 mm的打孔器沿著菌落邊緣打孔一周，制成菌碟。

1.3.2 測(cè)定EC50

采用生長(zhǎng)速率測(cè)定法測(cè)定EC50，所用藥劑為80%多菌靈可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑。多菌靈的濃度設(shè)置為：0(對(duì)照)、5、10、15、20、25 μg·mL-1，戊唑醇濃度設(shè)置為：0(對(duì)照)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg·mL-1，重復(fù)3次。把不同濃度的多菌靈藥液和戊唑醇藥液分別加到60 ℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基中，混勻制成含藥培養(yǎng)基。待平板凝固后把提前準(zhǔn)備好的菌碟放入其中，氣生菌絲朝上，每個(gè)皿接一個(gè)菌碟，進(jìn)行編號(hào)。接好的菌株置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用十字交叉測(cè)量法測(cè)量菌落的大小，取其平均值，與空白組對(duì)照比較得到菌落生長(zhǎng)抑制率，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

菜用大豆炭疽病在整個(gè)生長(zhǎng)周期均可發(fā)病，豆莢感病初期病斑呈褐色不規(guī)則點(diǎn)狀，后期逐漸長(zhǎng)大，一般病斑中心形成凹陷，凹陷部位呈黑色；葉片感病主要在葉脈上，發(fā)病部位初期變黃，后期擴(kuò)大成黑褐色不規(guī)則型病斑(圖1)。

圖1 菜用大豆炭疽病發(fā)病植株和不同發(fā)病程度豆莢

2.2 病原菌的菌落形態(tài)鑒定

通過組織分離法從所采集的疑似菜用大豆炭疽病病株上共分離出23個(gè)真菌分離物。對(duì)病株進(jìn)行病原菌的分離純化后，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后可觀察到兩種不同形態(tài)的菌落。第一種菌落是以Cts18為代表的圓形灰白色菌落，邊緣整齊，菌絲為灰白色，菌絲比較集中且呈絮狀(圖2-A)。第二種菌落是以Cts22為代表的菌落，邊緣不規(guī)則，氣生菌絲為白色絨毛狀，較密集，菌落周圍呈棕色(圖2-B)。

A，Cts18的菌落形態(tài)；B，Cts22的菌落形態(tài)。

2.3 病原菌的致病性

病原菌回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葉片接種后的發(fā)病率為100%。葉片接種培養(yǎng)7 d后，接種病原菌部位葉片呈黑褐色，發(fā)病情況與自然條件下一致；對(duì)照組葉片沒有觀察到病斑(圖3)。

A，對(duì)照；B，接種Cts18的葉片；C，接種Cts22的葉片。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以提取的病原菌DNA為模板，用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后均得到一條大小為600 bp左右的清晰條帶(圖4)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，Cts18與平頭炭疽菌(C.truncatum)的同源性為100%，Cts22與膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的同源性為100%。

圖4 菌株Cts18 和Cts22的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank里挑選出10種其他種類炭疽病病原菌的rDNA-ITS同源序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖5可知，Cts18與平頭炭疽菌(C.truncatum)的親緣關(guān)系最近，Cts22與膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的親緣關(guān)系最近，結(jié)合對(duì)病原菌菌落形態(tài)的觀測(cè)以及在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST比對(duì)結(jié)果，可以確定Cts18是半知菌亞門黑盤孢目炭疽菌屬的平頭炭疽菌(C.truncatum)；Cts22是半知菌亞門黑盤孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

圖5 基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 不同殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

為了篩選可以用于防控由平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22引起的菜用大豆炭疽病的殺菌劑，室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定了這兩個(gè)菌株對(duì)常用殺菌劑多菌靈和戊唑醇的藥劑敏感性。結(jié)果如表2所示，平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22對(duì)多菌靈的敏感性有顯著差異，Cts18的EC50為2.13 μg·mL-1，而Cts22的EC50為96.12 μg·mL-1。兩株菌對(duì)戊唑醇都很敏感，Cts18和Cts22的EC50分別為0.27 μg·mL-1和0.63 μg·mL-1?？梢?，戊唑醇的抑菌效果優(yōu)于多菌靈。

表2 不同藥劑對(duì)Cts18、Cts22的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬真菌分布廣泛，危害多種栽培植物，如黃瓜、西瓜、火龍果、番木瓜、核桃等[13-17]。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的炭疽菌菌株的背景及其ITS序列長(zhǎng)度

菜用大豆是一種重要的豆類蔬菜，生產(chǎn)上受到炭疽病危害巨大，主要發(fā)病時(shí)期為結(jié)莢期和鮮莢采收期，在豆莢表面形成不規(guī)則的黑褐色斑點(diǎn)，嚴(yán)重影響其外觀商品性和產(chǎn)量。前人研究表明，引起菜用大豆炭疽病的病原菌種類眾多，而且每一株炭疽病菌在形態(tài)特征、致病性、侵染規(guī)律、抗藥性等方面都不盡相同[7-9]。因此，準(zhǔn)確鑒定菜用大豆炭疽病病原菌種類對(duì)于其有效防控和致病機(jī)理研究以及抗性品種培育至關(guān)重要。本研究對(duì)在浙江地區(qū)采集到的疑似菜用大豆炭疽病病株進(jìn)行病原菌的分離純化鑒定，通過形態(tài)觀察和序列比對(duì)，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果鑒定出所采集的炭疽病致病菌為平頭炭疽菌(C.truncatum)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

生產(chǎn)上炭疽病的防治主要還是依賴化學(xué)防治。多菌靈和戊唑醇是目前生產(chǎn)上最常用的殺菌劑，但多菌靈和戊唑醇在國(guó)內(nèi)尚未登記用于菜用大豆炭疽病的防治。本文研究了這兩種藥劑對(duì)平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭炭疽菌Cts22的防治效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對(duì)平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22的EC50分別為2.13 μg·mL-1和96.12 μg·mL-1，該結(jié)果與霍建飛等[18]用多菌靈處理平頭炭疽菌的毒力測(cè)定結(jié)果以及李丹丹等[19]用多菌靈處理膠孢炭疽菌的毒力測(cè)定結(jié)果有一定差異，推測(cè)可能是不同地區(qū)的菌株對(duì)同種藥劑存在抗性差異。戊唑醇對(duì)平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22的EC50分別為0.27 μg·mL-1和0.63 μg·mL-1，與孫行杰等[20]在研究6種殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病菌的毒力測(cè)定中得出的結(jié)論相似。在本研究中平頭炭疽菌Cts18比膠孢炭疽菌Cts22對(duì)藥劑更加敏感，且戊唑醇的抑菌效果優(yōu)于多菌靈。本文研究結(jié)果為菜用大豆炭疽病的化學(xué)防治和進(jìn)一步致病機(jī)理研究和抗性品種培育奠定了一定基礎(chǔ)。