不同連作年限菊花根際土壤微生物多樣性變化特征

張曉波，于春雷，張文洋，閆 燁，阮 芳

(遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽111000)

菊花(Chrysanthemummorifolium)為菊科菊屬多年生草本花卉[1]，是我國十大傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一。我國是亞洲切花菊市場(chǎng)的主要供應(yīng)地，菊花主要產(chǎn)區(qū)多采用每年2.5～3.0茬的高效生產(chǎn)模式。連續(xù)種植3 a以上就會(huì)導(dǎo)致菊花連作障礙問題，病蟲害加重，植株生長發(fā)育不良，降低了切花的觀賞與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。

根際土壤微生物數(shù)量龐大且功能活躍，在植物生長方面的作用顯著[4]，是植物生長必不可少的基礎(chǔ)[5]。微生物多樣性、豐度和群落結(jié)構(gòu)是土壤生態(tài)系統(tǒng)功能和平衡的晴雨表[6]，能夠反映土壤的健康情況[7]。大量研究表明，長期連作一方面改變土壤基本理化性質(zhì)，造成土壤養(yǎng)分不平衡，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育[8]；另一方面影響根際土壤微生物活性，導(dǎo)致有害微生物增加，種群結(jié)構(gòu)失衡[9]，最典型的表現(xiàn)是病原菌增多，有益微生物減少，土傳植物病害頻繁發(fā)生[10]。顯然，根際微生態(tài)的變化是連作障礙的主要原因[11-12]，但不同連作年限菊花根際微生物多樣性變化尚不明晰。

土壤微生物常規(guī)的研究方法，比如平板培養(yǎng)法、生物鑒定系統(tǒng)法和標(biāo)記法，不能詳細(xì)統(tǒng)計(jì)出土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、生物多樣性信息，以及不同群體生理差異。第二代測(cè)序Illumina MiSeq憑借測(cè)序快、通量高和可信度高等優(yōu)勢(shì)，在根際土壤微生物區(qū)系研究中得到廣泛應(yīng)用[13-17]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，以不同連作年限菊花根際土壤為試驗(yàn)材料，揭示連作根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化特征，明確菊花連作障礙的形成機(jī)制，為菊花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采自長期種植菊花的日光溫室，位于遼寧省遼陽市白塔區(qū)遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所花卉研發(fā)區(qū)。菊花連作年限分別為無連作(CK)、連作2 a(2a)、連作9 a(9a)，每個(gè)年限設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)，統(tǒng)一進(jìn)行田間管理。2021年11月盛花期，按多點(diǎn)取樣法于每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取20株長勢(shì)均勻的菊花，采用抖根法收集根際土壤，混合均勻并分成2份，一份存放于-80 ℃超低溫冰箱用于土壤微生物分析，另一份4 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2 土壤DNA提取與MiSeq測(cè)序

樣本土壤總DNA的提取采用試劑盒(HiPure Soil DNA Mini Kit，廣州美基生物科技有限公司)。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA，Qubit2.0Flurometer檢測(cè)DNA樣品濃度。采用ABI GeneAmp?9700型PCR儀，用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因V3-V4區(qū)；以ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)作為引物，擴(kuò)增真菌ITS rRNA基因序列ITS1高變區(qū)。PCR反應(yīng)采用25 μL體系，其中含5×FastPfubuffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)2.5 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，F(xiàn)astPfupoglymerase 0.5 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27次循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫定量后，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行定量檢測(cè)，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。MiSeq測(cè)序分析由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Novaseq 6000高通量測(cè)序所得到的原始數(shù)據(jù)，利用Cutadapt(version 1.16)軟件除去其雙端序列接頭和低質(zhì)量堿基，再使用FLASH(v1.2.11)軟件進(jìn)行拼接。拼接后的原始序列通過Usearch(v7.0.1090)去除嵌合體序列從而得到優(yōu)質(zhì)序列。

使用UPARSE(v7.0.1090)將OTU(operational taxonomic unit)按照97.00%的相似性閾值聚類。并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。RDP Classifier針對(duì)Silva(SSU132)16S rRNA數(shù)據(jù)庫，使用70%的置信度閾值分析每個(gè)OTU代表序列的注釋結(jié)果。為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，精簡(jiǎn)去掉豐度值小于總序列條數(shù)0.001%的OTU，后續(xù)分析均使用精簡(jiǎn)后的OTU列表。

基于Mothur v.1.21.1軟件進(jìn)行稀釋曲線分析以揭示多樣性指數(shù)，包括Chao、ACE和Shannon多樣性指數(shù)。使用Bray-Curtis和PCoA分析比較群落差異，進(jìn)行β-多樣性分析。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(Duncan法)，顯著性水平選定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落OTU特異性

從菊花根際土壤微生物維恩圖(圖1)可知，CK、2a、9a 3個(gè)處理的土壤細(xì)菌OTU數(shù)量分別為5 408、6 534、6 041個(gè)(圖1-A)。其中，共有OTU 3 388個(gè)，占相應(yīng)樣品OTU總數(shù)量的63%、52%和56%；獨(dú)有OTU數(shù)量分別為1 044、1 210和859個(gè)，占相應(yīng)樣品OTU總數(shù)量的19%、19%和14%。CK、2a、9a 3個(gè)處理土壤真菌OTU分別有1 172、1 466、1 168個(gè)(圖1-B)。其中共有OTU 481個(gè)，占相應(yīng)樣品OTU總數(shù)量的41%、33%和41%；獨(dú)有OTU數(shù)量分別為382、557和304個(gè)，占相應(yīng)樣品OTU總數(shù)量的33%、38%和26%。上述結(jié)果可以看出，獨(dú)有OTU數(shù)量在連作2 a時(shí)最多，連作9 a時(shí)最少，2a、9a的共有OTU數(shù)量最多。表明短期連作可能引起某些土壤微生物的富集，但隨著連作年限延長，一些微生物種類喪失，導(dǎo)致根際土壤微生物群落多樣性發(fā)生改變。

圖1 不同連作年限菊花根際土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落維恩圖

2.2 細(xì)菌、真菌豐度和多樣性

如表1所示，真菌、細(xì)菌覆蓋度指數(shù)均在0.99以上，說明樣本序列檢出概率高，測(cè)序結(jié)果能夠說明不同種植年限菊花土壤微生物群落真實(shí)情況。隨著種植年限的增加菊花根際土壤細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均先升高后降低。2a和9a的細(xì)菌豐度指數(shù)顯著高于CK，兩者之間差異不顯著；不同年限真菌豐度指數(shù)沒有顯著性差異。群落多樣性指數(shù)方面，土壤細(xì)菌和真菌的Shannon指數(shù)與豐度指數(shù)變化趨勢(shì)相似，Simpson指數(shù)先降低后升高。其中，2a的細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著高于CK和9a。

表1 不同連作年限菊花根際土壤細(xì)菌和真菌群落豐富度與多樣性指數(shù)

2.3 細(xì)菌和真菌群落組成相似性

應(yīng)用R語言vegan包、vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析，將3個(gè)年限根際土壤微生物群落屬水平上豐度排名前50的物種進(jìn)行豐度相似性聚類，繪制heatmap圖。利用顏色深淺表示屬水平上群落組成的相似性和差異性，紅色表示相似性最高，藍(lán)色表示相似性最低。如圖2-A所示，3個(gè)年限根際土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度均有明顯差異，其中厭氧繩菌屬(Anaerolineaceae_uncultured)、RB41、酸桿菌屬(Acidobacteria_norank)、芽孢桿菌(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、Rhizomicrobium等細(xì)菌屬差異性較大。樣本間聚類結(jié)果顯示，2a與9a聚為一類；圖2-B顯示了真菌群落的相似性，其中，被孢霉屬(Mortierella)、未分類真菌屬、Olpidiaster_unclassified、明梭孢屬(Monographella)等相似性較大；異莖點(diǎn)霉屬(Paraphoma)、Gibellulopsis、毛殼菌屬(Chaetomiaceae_unclassified)、火絲菌屬(Pyronemataceae_unclassified)、土赤殼屬(Ilyonectria)等在不同年限根際土壤中差異性較大。樣本間聚類結(jié)果為CK與9a聚為一類。

圖2 不同連作年限菊花根際土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)屬水平群落熱圖

為了進(jìn)一步說明群落組成的相似性，對(duì)不同連作年限土壤樣本的OTU組成進(jìn)行PCoA分析，分別提取兩個(gè)主成分因子，用來表征細(xì)菌和真菌群落的特征。從細(xì)菌PCoA二維圖可知(圖3-A)，PC1是造成樣品差異性最大的主要因素，解釋度為50.54%；PC2次之，解釋度為17.75%，兩個(gè)主坐標(biāo)共解釋了68.29%的樣本信息。在PC1上，2a和9a距離較近，二者與CK距離較遠(yuǎn)，說明連作后的菊花根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。在真菌PCoA二維圖中(圖3-B)，兩個(gè)主坐標(biāo)PC1與PC3共解釋了50.44%的樣本信息。9a與CK距離更近，并與2a距離較遠(yuǎn)。在真菌群落結(jié)構(gòu)方面，CK與9a相似性更高，這與聚類熱圖對(duì)不同年限群落組成相似性分析結(jié)果一致。

圖3 不同連作年限菊花根際土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)PCoA分析

2.4 細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析

不同分類水平能夠具體反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)狀態(tài)，本研究分別在門分類水平和屬分類水平上對(duì)細(xì)菌、真菌菌群組成進(jìn)行分析。

在門分類水平上，土壤細(xì)菌分屬于45個(gè)門，共有主要菌門11個(gè)(圖4-A)，在3個(gè)年限細(xì)菌群落總數(shù)的占比分別為96.01%、96.25%、97.06%。土壤真菌共有主要菌門5個(gè)(圖4-B)，在3個(gè)年限真菌群落總數(shù)中占比分別為66.60%、84.01%、80.01%。從整體分布看，不同年限土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度變化較小，真菌群落相對(duì)豐度差異顯著。2a土壤真菌優(yōu)勢(shì)門以子囊菌門為主，CK、9a土壤真菌優(yōu)勢(shì)門以壺菌門和子囊菌門為主；2a、9a的子囊菌門相對(duì)豐度顯著高于CK。

A：Proteobacteria，變形菌門；Acidobacteria，酸桿菌門；Actinobacteria，放線菌門；Bacteroidetes，擬桿菌門；Chloroflexi，綠彎菌門；Gemmatimonadetes，芽單胞菌門；Saccharibacteria，糖桿菌門；Firmicutes，厚壁菌門；Nitrospirae，硝化螺旋菌門；Verrucomicrobia，疣微菌門；Planctomycetes，扁平菌綱；Others,其他。

在屬分類水平上，3個(gè)年限根際土壤細(xì)菌分屬于884個(gè)屬，除未鑒定的細(xì)菌屬外，主要隸屬于25個(gè)細(xì)菌屬，占比達(dá)到47%以上。如圖5-A所示，RB41、酸桿菌屬、黃桿菌屬、厭氧繩菌屬、亞硝化單胞菌屬為屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌。其中，RB41和酸桿菌屬為3個(gè)年限共有優(yōu)勢(shì)菌屬。與CK相比，2a、9a的酸桿菌屬相對(duì)豐度分別增加75.14%、35.00%，RB41相對(duì)豐度分別降低30.20%、53.02%。厭氧繩菌屬為2a、9a的優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度比CK增加了127.45%、31.97%。3個(gè)年限根際土壤真菌分屬于359個(gè)屬，除未鑒定的真菌屬外，主要隸屬于20個(gè)真菌屬，所占比例達(dá)到59%以上。如圖5-B所示，CK根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬有Olpidiaster、被孢霉屬、Gibellulopsis，2a根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬有被孢霉屬、火絲菌屬、Olpidiaster、明梭孢屬、鐮刀菌屬，9a根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬有Olpidiaster、被孢霉屬、明梭孢屬、毛殼菌屬、土赤殼屬。3個(gè)年限根際土壤真菌群落在屬水平上的組成和優(yōu)勢(shì)菌屬所占比例差異顯著，隨著種植年限的增加優(yōu)勢(shì)菌屬被孢霉屬相對(duì)豐度降低，明梭孢屬相對(duì)豐度增加，Olpidiaster先降低后升高。此外，2a、9a土壤鐮刀菌屬、土赤殼屬相對(duì)豐度增加。

A：Acidobacteria_noran，k酸桿菌屬；Anaerolineaceae_uncultured，厭氧繩菌屬_未培養(yǎng)；Flavobacterium，黃桿菌屬；Saccharibacteria_norank，糖桿菌屬；Nitrosomonadaceae_uncultured，亞硝化單胞菌屬_未培養(yǎng)；Gemmatimonadaceae_uncultured，芽單胞菌屬_未培養(yǎng)；Micrococcaceae_uncultured，微球菌屬；Sphingomonas，鞘氨醇單胞菌屬；Bacillus，芽孢桿菌；Nitrospira，硝化螺菌；Devosia，德沃斯氏菌屬；Ramlibacter，拉姆利氏桿菌；Cytophagaceae_uncultured，噬纖維菌屬_未培養(yǎng)；Rhizomicrobium，根霉菌屬；Bryobacter，苔蘚菌屬；Acidimicrobiales_uncultured，酸微菌屬_未培養(yǎng)；Comamonadaceae_unclassified，叢毛單胞菌屬_未培養(yǎng)；Blastocatellaceae_Subgroup_4_uncultured，酸桿菌屬_亞組_4_未培養(yǎng)；Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured，酸桿菌屬_亞組_1_未培養(yǎng)；Actinobacteria_norank，放線菌屬；Gemmatimonas，芽單胞菌屬；Others，其他。

3 討論

3.1 連作菊花對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

土壤微生物的多樣性和豐度反映土壤的質(zhì)量狀況[18]，多樣性指數(shù)對(duì)微生物群落變化具有指示作用[19]。本研究中，連作菊花根際土壤細(xì)菌ACE、Chao、Shannon指數(shù)升高，這與前人對(duì)大豆[20]、枸杞[21]連作后根際土壤細(xì)菌群落變化的研究結(jié)果不同，而與番茄[22]、棉花[23]、蕎麥[24]、桔梗[25]的研究結(jié)果相似。隨著菊花連作年限的增加，土壤細(xì)菌群落OTU呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，可能是由于連作初期(2 a)，菊花根系分泌的自毒物質(zhì)積累濃度較低，短期內(nèi)根際土壤細(xì)菌能夠利用根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)生長和繁殖，進(jìn)而出現(xiàn)短期連作后細(xì)菌群落多樣性和豐富度逐漸升高的現(xiàn)象[15，26]；而長期連作后(9 a)，菊花根系自毒作用占據(jù)主導(dǎo)地位，根際微生態(tài)環(huán)境平衡遭到破壞，細(xì)菌群落數(shù)量在達(dá)到峰值后呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。

土壤細(xì)菌種類眾多，功能各異，群落結(jié)構(gòu)組成易受外界環(huán)境的影響[27]。本研究中，菊花連作使土壤中酸桿菌門、綠彎菌門相對(duì)豐度增加，變形菌門、放線菌門等優(yōu)勢(shì)菌門群落數(shù)量發(fā)生不同程度變化。張媚等[13]對(duì)連作山核桃根際土壤進(jìn)行基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)酸桿菌門、變形菌門、厚壁菌門等含量與土壤pH值顯著相關(guān)。pH值作為土壤重要的基本理化性質(zhì)之一，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大[28-29]。Lauber等[30]研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門豐度與土壤pH值負(fù)相關(guān)。在菊花生產(chǎn)中，由于施肥特性和設(shè)施特定環(huán)境的共同作用，導(dǎo)致其栽培土壤鹽分積累，產(chǎn)生不同程度次生鹽漬化現(xiàn)象，進(jìn)而引起土壤pH值升高，影響群落結(jié)構(gòu)組成。此外，從整個(gè)土壤系統(tǒng)角度，土壤酸堿度改變會(huì)引起其他土壤特性的變化，如有機(jī)質(zhì)含量、營養(yǎng)物質(zhì)有效性、土壤酶功能等，這些因素均有可能導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[31]。以上結(jié)果表明，菊花連作改變了根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，土壤pH值升高是其變化的重要影響因素。

3.2 連作菊花對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

大量研究表明，連作使土壤細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增多[32-34]，土壤由細(xì)菌型向真菌型的轉(zhuǎn)換是造成連作障礙的主要原因[35-36]。本研究中，不同種植年限的真菌豐度和多樣性指數(shù)均表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但變化差異不顯著，說明連作菊花對(duì)根際土壤真菌群落多樣性和豐度影響較小。土壤菌群結(jié)構(gòu)與土壤抵抗逆境的能力密切相關(guān)[37]，在土壤微生態(tài)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。菊花連作對(duì)其土壤真菌群落組成影響較大，在門分類水平上，隨著連作年限的增加土壤中子囊菌門相對(duì)豐度增加，接合菌門、擔(dān)子菌門相對(duì)豐度減少；屬分類水平上，明梭孢屬、鐮刀菌屬、土赤殼屬等相對(duì)豐度增加，被孢霉屬相對(duì)豐度減少，這與前人研究結(jié)果相似[38-39]。子囊菌門和接合菌門多數(shù)為腐生菌，對(duì)分解植物殘?bào)w和降解土壤有機(jī)質(zhì)具有重要作用[40]，擔(dān)子菌門對(duì)木質(zhì)纖維素有較強(qiáng)的分解能力[41]；被孢霉屬真菌可通過影響土壤真菌群落組成和豐度，間接改變土壤碳、氮的轉(zhuǎn)化能力及其有效性[42]。通常在有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中豐度較高。張寧[43]研究表明，明梭孢屬與番茄發(fā)病率呈極顯著正相關(guān)。邵慧慧等[44]在西洋參銹腐病病原菌生物特性研究中發(fā)現(xiàn)，土赤殼屬真菌是引起西洋參銹腐病的主要病原菌，土赤殼屬真菌還能引起多種植物根腐病[45-46]、褐腐病[47-48]。由此說明，菊花連作使土壤根際真菌組成發(fā)生定向改變，具有提高土壤抗逆能力和植物抗性的菌群減少[26，49-51]，進(jìn)而引起有益菌對(duì)有害菌的拮抗作用減弱甚至消除[52]，由此導(dǎo)致一些病原菌群落的大量富集，在設(shè)施農(nóng)業(yè)特定環(huán)境下某些一般病害逐漸演變成主要病害，加重了菊花的連作障礙，對(duì)菊花的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

4 結(jié)論

通過對(duì)不同連作年限菊花根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性特征分析發(fā)現(xiàn)，連作顯著增加了根際土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性；細(xì)菌群落組成也發(fā)生改變，連作2 a和9 a菊花根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。連作對(duì)根際土壤真菌群落多樣性和豐度影響較小，但對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)組成影響顯著，在門與屬分類水平上，優(yōu)勢(shì)菌均發(fā)生改變。整體表現(xiàn)為，有益菌群減少，病原菌群富集。本研究對(duì)連作土壤細(xì)菌和真菌群落的代謝功能未作深入探討，待后續(xù)的工作中開展進(jìn)一步研究。