特應性皮炎患兒外周血miR-155 表達與Th1/ Th17 細胞及相關細胞因子的相關性分析

周曉宇 羅 亭 王潤超

湖北省十堰市太和醫院皮膚科，湖北十堰 442000

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是慢性炎癥性皮膚病，可引起患者劇烈瘙癢，多發于嬰幼兒期，隨著年齡增長患病率降低[1-4]。AD 發病與遺傳、表皮屏障破壞和免疫系統失調等因素有關[5]。輔助性T 細胞（T helper cell，Th cell）1、Th17 通過分泌細胞因子調控其他免疫細胞的活化和增殖，AD 患兒中Th1/Th17存在明顯失衡，Th17 細胞處于主導地位[6]。微RNA（micro RNA，MiR）-155 是一種重要的免疫系統調節劑，可靶向特定基因影響免疫細胞表型和細胞因子水平[7-8]。鑒于此，本研究擬探討miR-155 表達與Th1/Th17 的關系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年2 月至2021 年9 月湖北省十堰市太和醫院（以下簡稱“我院”）收治的89 例AD 患兒為AD 組，其中男49 例，女40 例；年齡2 個月～6 歲，平均（3.02±1.59）歲；體重指數14.5～17.3 kg/m2，平均（15.35±1.26）kg/m2。納入標準：①符合《中國兒童特應性皮炎診療共識（2017 版）》[9]；②年齡1 個月～12 歲；③患兒家屬知情同意。排除標準：①濕疹、脂溢性皮炎；②麻風、疥瘡、真菌病、皮膚細菌感染；③系統性自身免疫疾病。根據特應性皮炎評分指數[10]將AD 患者分為輕度組（0～24 分，28 例）、中度組（＞24～50 分，37 例）、重度組（＞50 分，24 例）。另選擇同期我院體檢的25 名健康兒童為對照組，其中男15 名，女10 名；年齡1 個月～7 歲，平均（3.11±1.62）歲；體重指數14.2～16.7kg/m2，平均（14.93±1.17）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經我院倫理委員會批準（2018-014）。

1.2 研究方法

所有受試者入組后24 h 內采集靜脈血6 ml，離心（相對離心力為699 g，離心半徑為15 cm）取上清液。miR-155 檢測：取外周全血樣本100 μl，采用Direct-Zol RNA MiniPrep（美國Zymo Research 公司，批號：190535）試劑盒分離總RNA，Nanodrop 分光光度計獲得A260/A280比值為1.8～2.1 的RNA，采用Prime-ScriptTNRT 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號：J02415）將總RNA 逆轉錄成cDNA。LightCycler 480?實時PCR 儀（瑞士羅氏公司）和PCR SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號：GF0527）進行PCR 反應，引物由Primer 5.0 軟件設計并由Sangon（China）合成。miR-155 正向引物：5’-CTCGTGGTTAATGCTAATTGTGA -3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 正向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，反向引物：5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTTG-3’。PCR 反應體系：Power SYBR?Green PCR Master Mix 2.5 μl，cDNA（12.5 ng）引物2 μl，RNase-Free ddH2O 21 μl。反應條件：95℃15 min，然后是40 個循環94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s。2-ΔΔCT法計算miR-155 相對表達量。

Th1/Th17 檢測：取肝素抗凝試管標本，加入熒光標記的鼠抗人CD4 抗體，APC 標記的鼠抗人白細胞介素（interleukin，IL）-7 抗體，PE 標記的鼠抗人RORγt抗體（武漢艾美捷科技有限公司，批號：203521），磷酸鹽緩沖液重懸，CytoFLEX 流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）檢測Th17 細胞占比、Th1 細胞占比，計算Th1/Th17。

Th1、Th17 相關細胞因子檢測：取血清樣本，Varioskan LUX 多功能酶標儀（美國賽默飛公司）應用酶鏈免疫吸附試驗法檢測Th1 細胞因子γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2，Th17 細胞因子IL-17和IL-23 水平，試劑盒購于美國賽默飛公司（批號：AF0268）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。計量資料數據用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關性分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AD 組與對照組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/ Th17 比較

AD 組miR-155 表達、Th17 細胞占比高于對照組，Th1 細胞占比、Th1/Th17 低于對照組（P ＜0.05）。見表1。

表1 AD 組和對照組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/Th17 比較（）

表1 AD 組和對照組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/Th17 比較（）

注AD：特應性皮炎；miR：微RNA；Th：輔助性T 細胞

2.2 AD 組與對照組Th1、Th17 相關細胞因子比較

AD 組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于對照組，

IL-17、IL-23 高于對照組（P ＜0.05）。見表2。

表2 AD 組與對照組Th1、Th17 相關細胞因子比較（）

表2 AD 組與對照組Th1、Th17 相關細胞因子比較（）

注AD：特應性皮炎；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細胞介素

2.3 AD 不同嚴重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/ Th17 比較

重度組miR-155 表達，Th17 細胞占比高于輕度組和中度組，Th1 細胞占比、Th1/Th17 低于輕度組和中度組；中度組miR-155 表達，Th17 細胞占比高于輕度組，Th1 細胞占比、Th1/Th17 低于輕度組（P ＜0.05）。見表3。

表3 AD 不同嚴重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/Th17 比較（）

表3 AD 不同嚴重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細胞占比、Th1/Th17 比較（）

注：與輕度組比較，aP ＜0.05，與中度組比較，bP ＜0.05。AD：特應性皮炎；miR：微RNA；Th：輔助性T 細胞

2.4 AD 不同嚴重程度亞組Th1、Th17 相關細胞因子比較

重度組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于輕度組和中度組，IL-17、IL-23 高于輕度組和中度組；中度組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于輕度組，IL-17、IL-23 高于輕度組（P ＜0.05）。見表4。

表4 AD 不同嚴重程度亞組Th1、Th17 相關細胞因子比較（）

表4 AD 不同嚴重程度亞組Th1、Th17 相關細胞因子比較（）

注 與輕度組比較，aP ＜0.05；與中度組比較，bP ＜0.05。AD：特應性皮炎；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細胞介素

2.5 miR-155 與Th1、Th17 及其相關細胞因子的相關性分析

AD 組患兒miR-155 表達與Th17 細胞占比、IL-17、IL-23 呈正相關（r=0.541、0.402、0.295，P ＜0.05），與Th1 細胞占比、Th1/Th17、IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17呈負相關（r=-0.571、-0.607、-0.432、-0.321、-0.409，P ＜0.05）。

3 討論

AD 與皮膚屏障功能受損和特應性背景有關，刺激物、接觸過敏原、食物等均可誘發AD[11-12]。免疫反應在AD 發病機制中發揮關鍵作用，T 淋巴細胞亞群間不平衡導致細胞介導的免疫反應改變，促進免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的超敏反應，引起表皮炎癥和屏障功能障礙[13-14]。miRNA 與免疫和炎癥疾病密切相關，可通過激活先天免疫細胞，引起慢性炎癥來促進哮喘、過敏性鼻炎和AD 等疾病的發展[15]。

miR-155 是來源于B 細胞整合簇基因的一個外顯子，與信使RNA3’UTR 結合調控基因表達，免疫細胞發育和適應性免疫應答[16]，通過靶向c-Fos 促使樹突細胞成熟，上調抗原呈遞細胞表面主要組織相容性復合體Ⅱ和共刺激分子表達，間接激活CD4+T 細胞并促使初始CD4+T 細胞增殖分化[17]。有報道顯示，miR-155 分別通過靶向含SH2 結構域的肌醇5-磷酸酶1和細胞因子信號抑制因子-1 激活巨噬細胞，誘導膿毒癥急性肺部炎癥反應[18]。在過敏性鼻炎中，下調miR-155 可調控其下游靶標GATA 連接蛋白3，抑制Th2 細胞因子減輕過敏性反應[19]。miR-155 還通過調節活性氧-環氧合酶-2 軸參與哮喘氣道炎癥反應[20]。本研究結果顯示，miR-155 在AD 患兒外周血中表達上調，且隨著病情加重表達增加，提示miR-155 過表達與AD 發病和病情進展可能有關。動物研究顯示，AD 小鼠miR-155 表達，IgE、腫瘤壞死因子-α、IL-6水平均增高[21]，Bergallo 等[22]研究顯示，AD 患兒miR-155 表達增高且與AD 免疫失調有關。

本研究結果顯示，miR-155 過表達與AD 患兒Th1/Th17 失衡有關。Th17 是能分泌IL-17 的T 淋巴細胞亞群，其產生的IL-17 能有效介導中性粒細胞激活，誘發炎癥反應。Th1 參與細胞免疫調節，輔助細胞毒性T 細胞分化，介導細胞免疫應答等[23]。本研究結果顯示，AD 患兒Th1/Th17 向Th17 偏移，與王相華等[24]報道類似。可能是因為miR-155 通過下調細胞因子信號抑制因子-1 的表達來增強Th17 細胞分化，還可通過靶向IFN-γ 受體α 鏈促進Th1 細胞極化，調控Th1/Th17 平衡[17]。因此，miR-155 過表達可能引起Th17過度分化，導致Th1/Th17 失衡，當敲除miR-155 后則可抑制Th17 細胞分化，抑制T 細胞介導的炎癥反應，恢復Th1/Th17 平衡[25]。

綜上，AD 患兒外周血miR-155 表達增高，miR-155 高表達與Th1/Th17 失衡及Th1、Th17 相關細胞因子異常有關；miR-155 可能通過調節Th1/Th17參與AD 發病過程。本研究不足之處在于樣本量較少，尚需進一步擴大樣本例數加以證實。