淡水中總氮濃度簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定方法與技術(shù)探究*

孫 巍 朱 穎 李長(zhǎng)秀 陳心如 鄺春議 盧勇杰 李嘉敬 韋明肯

(廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000)

總氮是水中無(wú)機(jī)氮(包括氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮)和有機(jī)氮的總和，是衡量水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)之一[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的快速增長(zhǎng)，大量含氮廢水被排入水體，導(dǎo)致水中有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮含量過(guò)高，微生物大量繁殖，出現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)[2]。因此，總氮的測(cè)定是當(dāng)今水質(zhì)監(jiān)測(cè)的重要環(huán)境參數(shù)之一。

1 總氮測(cè)定方法

目前，淡水水體中主要的總氮測(cè)定方法及其優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表1。

國(guó)標(biāo)法是測(cè)定淡水中總氮含量的常用方法，原理簡(jiǎn)單、使用儀器簡(jiǎn)單、對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低、應(yīng)用較廣泛，但該方法需要用到高壓滅菌鍋進(jìn)行消解，操作繁瑣且影響因素較多不易控制，使得測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較低，給實(shí)驗(yàn)者帶來(lái)較多困難；容易受到外界因素干擾，影響測(cè)定結(jié)果；反應(yīng)體系過(guò)大、操作不方便導(dǎo)致不能滿足樣品批量測(cè)試，同時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)。其他5種測(cè)定方法檢測(cè)準(zhǔn)確、快速、靈敏，但需要依賴大型分析儀器，一般實(shí)驗(yàn)室難以普及應(yīng)用。

表1 總氮的測(cè)定方法及其優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Determination methods of total nitrogen and their advantages and disadvantages

基于HJ 636—2012，本研究擬采用15 mL消解管和總氮消解儀分別取代HJ 636—2012中的25 mL比色管和高壓滅菌鍋消解樣品，建立一種小體系總氮測(cè)定的新方法(簡(jiǎn)稱新方法)，探究新方法的影響因素，并將新方法與國(guó)標(biāo)法進(jìn)行比較，通過(guò)線性擬合、正交驗(yàn)證、F和t檢驗(yàn)等驗(yàn)證新方法的精密性和準(zhǔn)確性。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

UV-1800PC紫外分光光度計(jì)；25 mL比色管；緊固式LX-B35L自控壓力蒸汽滅菌鍋；15 mL消解管；LH-25A智能多參數(shù)消解儀(340 mm×240 mm×214 mm，消解數(shù)量為25支，消解溫度為45～190 ℃，額定電壓為220 V)。

參照HJ 636—2012，配制(1+9)鹽酸溶液、40 g/L堿性過(guò)硫酸鉀溶液、10.0 mg/L硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

2.2.1 影響因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

(1) 消解液用量：堿性過(guò)硫酸鉀溶液變更為1.9、2.0、2.1、2.2、2.3 mL。

(2) 消解時(shí)間：消解時(shí)間變更為10、20、30、40、50 min。

(3) 水體鹽度：工作液中加入不同濃度的氯化鈉改變水體鹽度為0、0.25%、0.50%、0.75%、1.50%，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

(4) pH：工作液調(diào)節(jié)pH為1、3、5、7、9、11，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.2 總氮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及其擬合驗(yàn)證

根據(jù)2.2.1節(jié)確定的優(yōu)化條件，參照HJ 636—2012繪制總氮標(biāo)準(zhǔn)曲線。新方法總氮標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)步驟：(1)分別量取0、0.1、0.2、0.4、1.2、2.8 mL硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)使用液于15 mL消解管中，加超純水稀釋至4 mL，此時(shí)對(duì)應(yīng)總氮分別為0、0.25、0.50、1.00、3.00、7.00 mg/L。(2)加入2.0 mL堿性過(guò)硫酸鉀溶液，擰緊瓶蓋，混勻。(3)將消解管置于消解儀中加熱至120 ℃開(kāi)始消解，在120～124 ℃保持30 min，冷卻至室溫后將瓶中液體顛倒混勻2～3次。(4)分別加入0.4 mL鹽酸溶液，加超純水稀釋至10 mL標(biāo)線，混勻。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A220、A275，并計(jì)算總氮吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)兩種方法的總氮標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合，且采用正交驗(yàn)證和t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以此證明新方法的可行性。

2.2.3 確定新方法的總氮線性測(cè)定范圍

二要積極爭(zhēng)取中央和省市補(bǔ)助資金，充分發(fā)揮政府及有關(guān)部門(mén)的職能作用，吃透上級(jí)政策，加強(qiáng)溝通協(xié)調(diào)，積極提報(bào)水利重點(diǎn)項(xiàng)目，做好項(xiàng)目前期工作，用優(yōu)良的投入收益率和先進(jìn)的項(xiàng)目理念，爭(zhēng)取國(guó)家的項(xiàng)目投資和上級(jí)的政策支持。

在優(yōu)化條件下，對(duì)工作液濃度范圍進(jìn)行擴(kuò)大，分別設(shè)定工作液的總氮為0、0.25、0.50、1.00、3.00、7.00、11.00、12.00、13.00、14.00、20.00、25.00 mg/L，確定總氮線性測(cè)定范圍。

2.2.4 實(shí)測(cè)環(huán)境樣品的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

分別在廣東省茂名市兩個(gè)區(qū)域(茂南區(qū)(3個(gè)水樣)和化州市(2個(gè)水樣))采集并實(shí)測(cè)水樣。水樣采集完畢，送回實(shí)驗(yàn)室后放入冰箱保存。采用兩種方法測(cè)定總氮濃度。由于部分樣品總氮濃度較高，測(cè)定前需進(jìn)行相應(yīng)地梯度稀釋。對(duì)水樣的兩種測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行F、t檢驗(yàn)，擬證明新方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果與討論

3.1 消解液用量的優(yōu)化

在高溫堿性介質(zhì)下，堿性過(guò)硫酸鉀將水中氨氮、亞硝酸鹽氮和大部分有機(jī)氮氧化為硝酸鹽，因此消解液用量是影響實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素。相同總氮濃度下，當(dāng)消解液用量為1.9～2.0 mL時(shí)，吸光度呈上升趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)，1.9 mL時(shí)吸光度較低的原因是堿性過(guò)硫酸鉀不足，不能與水中含氮化合物完全反應(yīng)，導(dǎo)致吸光度較低；當(dāng)消解液用量為2.0～2.3 mL時(shí)，吸光度總體呈下降趨勢(shì)，2.0 mL時(shí)吸光度達(dá)到峰值。因此，新方法的消解液用量最佳為2.0 mL。

圖1 消解液用量對(duì)新方法總氮測(cè)定的影響Fig.1 Effect of the amount of digestion solution on the determination of total nitrogen by the new method

3.2 消解時(shí)間的優(yōu)化

相同總氮濃度下，當(dāng)消解時(shí)間為10～30 min時(shí)，吸光度總體呈上升趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)，其原因是因?yàn)橄鈺r(shí)間的延長(zhǎng)使堿性過(guò)硫酸鉀氧化底物更徹底；當(dāng)消解時(shí)間為30～50 min時(shí)，吸光度總體呈下降趨勢(shì)，但下降趨勢(shì)不明顯，整體穩(wěn)定性較差。30 min時(shí)吸光度總體達(dá)到峰值，且該消解時(shí)間下的數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，因此消解時(shí)間最佳為30 min。

3.3 水體鹽度的優(yōu)化

水體鹽度是影響總氮測(cè)定的重要因素之一。李碧瑩等[13]研究表明，鹽度小于0.4%的水體適用HJ 636—2012，而鹽度大于1.8%的水體需用《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第4部分：海水分析》(GB 17378.4—2007)，而鹽度為0.4%～1.8%的養(yǎng)殖水體需將鹽度稀釋到小于0.4%再根據(jù)HJ 636—2012測(cè)定。因此，確定總氮測(cè)定適用的水體鹽度范圍有利于明確總氮測(cè)定的適用性，可以對(duì)水樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，從而保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。由圖3可見(jiàn)，相同總氮濃度下，總體上，當(dāng)水體鹽度為0～0.5%時(shí)，吸光度呈下降趨勢(shì)；當(dāng)水體鹽度大于0.5%時(shí)，吸光度呈上升趨勢(shì)，且總氮濃度越高，增長(zhǎng)幅度越大。由于整體數(shù)據(jù)波動(dòng)幅度較小，需進(jìn)行進(jìn)一步顯著性分析。經(jīng)置信度為95%的F檢驗(yàn)，水體鹽度對(duì)新方法測(cè)定結(jié)果的F值為0.016，小于F檢驗(yàn)臨界值表中的2.759，說(shuō)明水體鹽度為0～1.5%對(duì)新方法測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異，即新方法水體鹽度范圍較大，可適用于水體鹽度較高的環(huán)境樣品測(cè)定。與國(guó)標(biāo)法相比，新方法對(duì)不同水體鹽度的總氮測(cè)定的適用性也更明確。

圖2 消解時(shí)間對(duì)新方法總氮測(cè)定的影響Fig.2 Effect of digestion time on the determination of total nitrogen by the new method

圖3 水體鹽度對(duì)新方法總氮測(cè)定的影響Fig.3 Effect of water salinity on the determination of total nitrogen by the new method

3.4 pH的優(yōu)化

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)總氮為0.25～1.00 mg/L時(shí)，pH對(duì)吸光度影響較低，整體數(shù)據(jù)較穩(wěn)定；當(dāng)總氮大于1.00 mg/L時(shí)，pH對(duì)總氮測(cè)定的影響增大。經(jīng)置信度為95%的F檢驗(yàn)，pH對(duì)新方法測(cè)定結(jié)果的F值為0.028，小于F檢驗(yàn)臨界值表中的2.524，說(shuō)明pH對(duì)新方法測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異。整體分析，當(dāng)處于中性或堿性時(shí)，吸光度穩(wěn)定性較好。綜上所述，新方法最適pH范圍應(yīng)為中性或堿性。

圖4 水體pH對(duì)新方法總氮濃度測(cè)定的影響Fig.4 Effect of water pH on total nitrogen concentration determination by new method

3.5 在優(yōu)化條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

綜合確定優(yōu)化條件為消解液用量2.0 mL、消解時(shí)間30 min、pH調(diào)至7以上。在優(yōu)化條件下繪制新方法和國(guó)標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的線性回歸方程分別見(jiàn)式(1)和式(2)。可見(jiàn)，兩種方法都具有很好的線性回歸關(guān)系。為進(jìn)一步確定新方法的準(zhǔn)確性，采用正交驗(yàn)證法對(duì)兩種方法進(jìn)行交叉檢驗(yàn)和線性擬合，得到的線性方程見(jiàn)式(3)，說(shuō)明兩種方法的測(cè)定結(jié)果高度一致。經(jīng)置信度為95%的t檢驗(yàn)，兩種方法的Sig.=0.948>0.05，進(jìn)一步證實(shí)兩種方法不存在顯著性差異，說(shuō)明新方法可行性較高。

Y=0.046 8X-0.004，R2=0.999 8

(1)

Y=0.045 5X-0.002，R2=0.999 6

(2)

Y15=1.029 6Y25+0.002 3，R2=0.999 2

(3)

式中：Y為吸光度；X為總氮質(zhì)量濃度，mg/L；Y15為新方法測(cè)定的吸光度；Y25為國(guó)標(biāo)法測(cè)定的吸光度。

3.6 新方法線性測(cè)定范圍

由圖5可見(jiàn)，當(dāng)總氮為0～11.00 mg/L時(shí)，總氮與吸光度呈線性關(guān)系，R2=0.999 7；當(dāng)總氮超過(guò)11.00 mg/L時(shí)，吸光度增長(zhǎng)幅度降低，線性相關(guān)系數(shù)下降，穩(wěn)定性減弱?？纱_定新方法線性測(cè)定范圍為0～11.00 mg/L，是HJ 636—2012(0～7 mg/L)的1.6倍。新方法明顯提高了總氮的測(cè)定上線，可對(duì)較高的總氮濃度進(jìn)行有效測(cè)定，節(jié)省了多梯度稀釋所消耗的時(shí)間和成本。

圖5 新方法總氮的線性測(cè)定范圍Fig.5 Linear determination range of total nitrogen by the new method

3.7 實(shí)測(cè)環(huán)境樣品的交叉驗(yàn)證

用兩種方法分別檢測(cè)茂名市茂南區(qū)和化州市的水樣，并采用正交驗(yàn)證法進(jìn)行比較，擬合結(jié)果見(jiàn)圖6。兩種方法測(cè)定結(jié)果擬合的R2=0.998 2，線性關(guān)系良好。

圖6 新方法與國(guó)標(biāo)法總氮測(cè)定結(jié)果的正交驗(yàn)證曲線Fig.6 Orthogonal validation curve between the new method and the national standard method for determination of total nitrogen

為進(jìn)一步驗(yàn)證新方法的可行性，對(duì)兩種測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行F、t檢驗(yàn)。經(jīng)置信度為95%的F檢驗(yàn)，新方法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的F值為0.009，小于F檢驗(yàn)臨界值表中的5.318，說(shuō)明兩種方法不存在顯著性差異。經(jīng)置信度為95%的t檢驗(yàn)，新方法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的Sig.=0.928>0.05，進(jìn)一步證實(shí)兩種方法無(wú)顯著性差異。綜上所述，新方法測(cè)定淡水總氮濃度的準(zhǔn)確度高，具有可行性。

4 結(jié) 語(yǔ)

水體總氮含量對(duì)于環(huán)境的影響越來(lái)越重要，常規(guī)總氮測(cè)定方法存在操作體積過(guò)大、消解困難、藥品成本高等問(wèn)題。本研究用15 mL消解管代替HJ 636—2012中的25 mL比色管，避免了溶液高溫消解溢出或氨氣溢出的現(xiàn)象，提高了線性關(guān)系，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，降低了藥品成本。與國(guó)標(biāo)法相比，新方法具有更好的水體鹽度范圍適用性，準(zhǔn)確性和精密度高，總氮線性測(cè)定范圍擴(kuò)大到0～11.00 mg/L，可更有效測(cè)定較高總氮濃度的樣品，節(jié)省稀釋成本和時(shí)間。綜上所述，新方法使總氮濃度的測(cè)定工作更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，提高了工作效率，為實(shí)驗(yàn)室大批量測(cè)定淡水總氮濃度提供了可行性。