基于電子鼻和頂空氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不同產(chǎn)地北柴胡氣味差異分析△

軒菲洋，姜丹，申小營(yíng)，周娜，任廣喜，劉春生

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根。按性狀不同，分別習(xí)稱北柴胡和南柴胡。柴胡氣辛，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽(yáng)舉氣等功效[1]。柴胡作為傳統(tǒng)解表藥物，其揮發(fā)油類化合物是其發(fā)揮解熱、抗炎作用的主要成分[2]。前人對(duì)柴胡揮發(fā)油的提取方法及不同種柴胡的揮發(fā)油差異情況進(jìn)行了分析[3-4]，但是對(duì)于不同產(chǎn)地北柴胡氣味差異和揮發(fā)性成分綜合分析，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

電子鼻是模擬人類嗅覺(jué)系統(tǒng)而研制的一種氣味檢測(cè)儀器，利用各個(gè)傳感器對(duì)復(fù)雜氣體響應(yīng)不同的特點(diǎn)，快速對(duì)多種氣味進(jìn)行識(shí)別，客觀分析與評(píng)定藥材氣味特征，以氣味特征為指標(biāo)快速鑒別和評(píng)價(jià)藥材，因此在中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域得到了大量應(yīng)用[5-8]。頂空氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-GC-MS）可對(duì)多組分混合物進(jìn)行快速定性及單組分相對(duì)定量的分析，GC-MS 目前多應(yīng)用于藥材質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)，通過(guò)建立質(zhì)量評(píng)價(jià)模型分析微量揮發(fā)性組分，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品質(zhì)藥材揮發(fā)性物質(zhì)基礎(chǔ)的分析[9]。電子鼻和HSGC-MS 分析，將中藥材的外在氣味性狀和揮發(fā)性物質(zhì)的組成分析相結(jié)合，能快速鑒定不同氣味差異的藥材，并解析相應(yīng)氣味產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。本研究采用電子鼻和GC-MS 聯(lián)用的方式對(duì)來(lái)自3 個(gè)地區(qū)9個(gè)市共18 批北柴胡藥材綜合分析，從而對(duì)北柴胡產(chǎn)生的氣味進(jìn)行量化分析，并對(duì)氣味產(chǎn)生的具體化學(xué)成分做進(jìn)一步解析，以期為柴胡氣味產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材

柴胡藥材分別采自山西省、黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)3個(gè)地區(qū)9個(gè)市，共18份樣品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 柴胡樣品采樣信息

1.2 儀器

α-Fox3000 型氣味指紋分析儀（法國(guó)Alpha M.O.S公司），由自動(dòng)頂空進(jìn)樣儀HS100和主機(jī)兩部分組成，主機(jī)中安裝有12 根MOS 傳感器。12 根傳感器敏感成分見(jiàn)表2。

表2 電子鼻傳感器敏感成分

7697A HS-7890B GC-5977A MS 型頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；BSA124S 型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FW200 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法

2.1 不同產(chǎn)地柴胡樣品揮發(fā)性成分的電子鼻測(cè)定

精密稱取藥材樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.20 g 裝入10 mL 頂空瓶中密封；孵化箱溫度60 ℃；孵化時(shí)間360 s；樣品振蕩速度250 r·min-1；以純凈空氣為載氣，載氣流速為150 mL·min-1；注射體積2000 μL；注射速度為2000 μL·s-1，注射針溫度為70 ℃；數(shù)據(jù)采集時(shí)間為120 s，數(shù)據(jù)采集延遲時(shí)間600 s，每個(gè)樣品重復(fù)5次[11]。

2.2 不同產(chǎn)地柴胡樣品揮發(fā)性成分的HS-GC-MS測(cè)定

樣品制備：將柴胡用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)四號(hào)篩。稱取柴胡粉末1 g 迅速裝入20 mL 頂空進(jìn)樣瓶，加蓋密封，待測(cè)。色譜條件：HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm），樣口溫度130 ℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速1.0 mL·min-1；柱流量控制模式為恒流；升溫程序：初始柱溫40 ℃，以1.5 ℃·min-1升至70 ℃，以10 ℃·min-1升至210 ℃。后運(yùn)行溫度230 ℃，5 min。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊離子源（EI），碰撞能量為70 eV，全離子掃描模式，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，接口溫度130 ℃；溶劑延遲3 min。頂空條件：孵育溫度120 ℃，定量環(huán)/閥溫度130 ℃，傳輸線溫度130 ℃，GC 循環(huán)時(shí)間55 min，孵育時(shí)間40 min，進(jìn)樣量1000 μL[12]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品電子鼻各傳感器5 次測(cè)定的均值為特征值，進(jìn)行主成分分析（PCA）及線性判別分析（LDA）。HS-GC-MS 檢測(cè)時(shí)化合物的鑒定采用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)（https://webbook.nist.gov/chemistry/）檢索（匹配度＞90%）和參考相關(guān)文獻(xiàn)。利用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。利用SIMCA 14.0軟件對(duì)共有成分做偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）篩選變量投影重要性（VIP）值＞1 的潛在差異成分，對(duì)挑選出的不同產(chǎn)地差異成分及特有成分分別進(jìn)行PCA；17個(gè)化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和12根傳感器特征值作PLS-DA。用Unscrambler 10.4 繪制雙標(biāo)圖呈現(xiàn)PCA和PLS-DA 兩向數(shù)據(jù)表所得出的結(jié)果，分析本研究中傳感器-揮發(fā)性化合物兩向數(shù)據(jù)可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行直觀比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地柴胡電子鼻分析

3.1.1 電子鼻不同傳感器對(duì)柴胡氣味的響應(yīng)值 分析JB1樣品的電子鼻12個(gè)傳感器的檢測(cè)響應(yīng)圖（圖1）。橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)應(yīng)各傳感器的相對(duì)電阻變化率[（R0-R）/R0]。R0為初始的電阻值，R為隨時(shí)間變化的響應(yīng)電阻值。每條曲線代表一個(gè)傳感器在120 s內(nèi)的響應(yīng)變化。樣品采集后，各傳感器響應(yīng)值隨著揮發(fā)性氣體在傳感器上富集，傳感器響應(yīng)值迅速增大，各個(gè)傳感器響應(yīng)值在不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大后，又逐漸下降趨于平穩(wěn)。

圖1 電子鼻12個(gè)傳感器對(duì)柴胡樣品（JB1）的響應(yīng)曲線

3.1.2 不同產(chǎn)地柴胡樣品電子鼻特征氣味差異分析 選取數(shù)據(jù)采集120 s內(nèi)傳感器最大響應(yīng)值，繪制柴胡樣品的電子鼻特征氣味的雷達(dá)指紋圖（圖2）。12 根傳感器對(duì)樣品揮發(fā)性成分的響應(yīng)不同，其差異主要體現(xiàn)在S7～S12 6 根傳感器上。S7～S12 對(duì)甲烷、氟、芳香類、乙醇、氨氣、有機(jī)胺類較敏感，推測(cè)不同產(chǎn)地柴胡氣味差異主要表現(xiàn)在烴類、芳香類、胺類等揮發(fā)性物質(zhì)的差異。

圖2 18批柴胡樣品各電子鼻傳感器響應(yīng)值的雷達(dá)圖

3.1.3 不同產(chǎn)地柴胡電子鼻監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的PCA 對(duì)不同產(chǎn)地柴胡的氣味采用PCA，由圖3 可知，主成分1（PC1）由S7、S11、S8、S12、S10、S9、S1組成，方差貢獻(xiàn)率為51.01%，PC2 由S4、S5、S2、S3、S6 組成，方差貢獻(xiàn)率為36.84%，PC1 和PC2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.85%，說(shuō)明2 個(gè)主成分包含了原始數(shù)據(jù)的多數(shù)信息。還可以看出不同地區(qū)之間，山西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的柴胡樣本氣味更接近，與黑龍江省樣本氣味差異較大；在山西省內(nèi)，晉南氣味多樣性較晉北豐富；在黑龍江省內(nèi)，采自大慶的樣本與采自齊齊哈爾的樣本氣味差異性較大。利用電子鼻數(shù)據(jù)的PCA 仍不能將不同產(chǎn)地柴胡進(jìn)行區(qū)分。

圖3 不同區(qū)域柴胡電子鼻數(shù)據(jù)的PCA

3.1.4 不同產(chǎn)地柴胡電子鼻監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的LDA LDA是模式識(shí)別的經(jīng)典算法，其主要過(guò)程是對(duì)檢測(cè)樣本賦值，并將分類后的樣本信息投射到一維象限中，使得投影后組內(nèi)方差最小，組間方差最大[13]。本研究中，對(duì)電子鼻傳感器感應(yīng)到的揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)做進(jìn)一步處理，通過(guò)縮小組內(nèi)方差，擴(kuò)大組間方差，更直觀反映不同組之間的差異。結(jié)果見(jiàn)圖4，判別式LD1 和LD2 的方差區(qū)分度分別是79.51%和20.42%，總方差區(qū)分度達(dá)99.93%，可以較好地反映不同樣品的氣味信息。不同產(chǎn)地樣品之間區(qū)分明顯，晉南和晉北柴胡氣味相近但也存在一定差異，黑龍江省柴胡和內(nèi)蒙古柴胡的氣味與山西柴胡有明顯差異。因此可以得出，晉北、晉南、內(nèi)蒙古和黑龍江的柴胡樣品電子鼻數(shù)據(jù)LDA 相較于PCA，區(qū)分效果更好。

圖4 不同區(qū)域柴胡電子鼻響應(yīng)值的LDA

3.2 不同產(chǎn)地柴胡樣品的GC-MS分析

3.2.1 不同區(qū)域柴胡樣品的GC-MS 分析總體差異分析 采用HS-GC-MS 對(duì)采自3 個(gè)地區(qū)18 個(gè)產(chǎn)地的柴胡樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，利用Nist 庫(kù)進(jìn)行定性分析（匹配度達(dá)到90%以上），共鑒別出76 個(gè)成分（表3），其中烷烴類6 個(gè)、烯烴類15 個(gè)、醇類14 個(gè)、醛類16 個(gè)、酮類7 個(gè)、酯類9 個(gè)、芳香類7個(gè)、胺類及羧酸各1 個(gè)。采用面積歸一化法，根據(jù)不同化合物峰面積計(jì)算相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)不同區(qū)域內(nèi)的柴胡樣品進(jìn)行了分析，并繪制了堆積圖（圖5），不同產(chǎn)地柴胡樣品之間醛類、醇類、芳香類、胺類等化合物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯。

圖5 不同區(qū)域柴胡各類型揮發(fā)性物質(zhì)分析比較結(jié)果

表3 18批柴胡中揮發(fā)性成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

續(xù)表3

續(xù)表3

3.2.2 不同區(qū)域柴胡樣品主要差異類型揮發(fā)性物質(zhì)的對(duì)比分析 所有柴胡樣品的醛類化合物的共有成分有16 種，其中己醛的含量變化在不同產(chǎn)地之間差異較大，其在晉北樣品中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（78.17%）是黑龍江樣品（13.98%）的5 倍。庚醛在內(nèi)蒙古樣品的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10.87%）明顯高于晉南（0.34%）、晉北（0.28%）和黑龍江（0.02%）樣品，辛醛在內(nèi)蒙古樣品的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.56%）明顯高于晉南（0.09%）、晉北（0.05%）和黑龍江（0）。部分醛類化合物在不同產(chǎn)地柴胡中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，可能為不同產(chǎn)區(qū)柴胡氣味差異的依據(jù)。不同產(chǎn)區(qū)柴胡樣品芳香類化合物共有成分4 種，其中2-正戊基呋喃在內(nèi)蒙古樣品的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（13.79%）明顯高于山西和黑龍江（0）；對(duì)異丙基甲苯、1-甲基-4-(1-丙烯-1-基)苯、4-甲基苯酚3 種芳香類物質(zhì)是黑龍江和山西特有的芳香類化合物，其中對(duì)異丙基甲苯在黑龍江齊齊哈爾的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（65.26%）是山西（11.19%）的6 倍。不同產(chǎn)區(qū)柴胡樣品的醇類化合物共有成分14 種，其中1-戊醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同產(chǎn)地之間差異較大，晉北（9.84%）是黑龍江（2.00%）的5 倍，且兩者均遠(yuǎn)高于內(nèi)蒙古（0.04%）樣品。不同產(chǎn)區(qū)柴胡樣品的胺類化合物共有成分是三乙胺，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)蒙古樣品（9.17%）遠(yuǎn)高于山西（0.04%）和黑龍江（0）樣品。

為了確定哪類揮發(fā)性成分在區(qū)分不同產(chǎn)地柴胡上起了重要作用，利用SIMCA 14.0軟件對(duì)不同產(chǎn)地柴胡揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，篩選出VIP＞1 的具有顯著性差異的成分有11 個(gè)。這些成分可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地柴胡的依據(jù)。同時(shí)挑選出不同產(chǎn)地的7 個(gè)特有成分，將其看作區(qū)分不同產(chǎn)地柴胡的關(guān)鍵成分。分別用顯著性差異成分和特有成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)作PCA圖（圖6），在顯著性差異成分的PCA圖中指向性更明顯（圖6A），內(nèi)蒙古柴胡在第一象限，2-正戊基呋喃（C9）、α-蒎烯（C14）、β-蒎烯（C16）、庚醛（C47）、三乙胺（C75）指向該區(qū)域；黑龍江柴胡在第四象限，十一烷（C5）、對(duì)異丙基甲苯（C7）落在該區(qū)域；晉北柴胡落在第二象限，2-正丁基呋喃（C11）、1-戊醇（C42）、己醛（C43）、2-辛酮（C63）指向該區(qū)域；晉南柴胡落在二、三象限，位于晉北柴胡和內(nèi)蒙古柴胡之間，表明上述化合物在區(qū)分不同產(chǎn)地柴胡時(shí)起著重要作用；而利用不同產(chǎn)地的7個(gè)特有性成分進(jìn)行PCA（圖6B）可以看出，在第一象限中既存在晉南柴胡樣品，也存在黑龍江柴胡樣品；第二象限中既存在晉北產(chǎn)區(qū)柴胡樣品，也存在黑龍江及內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)柴胡樣品；第三象限中雖然僅為山西省柴胡樣品，但晉南樣品和晉北樣品均存在，說(shuō)明不能利用7 個(gè)特異性成分的PCA 對(duì)柴胡樣品的產(chǎn)區(qū)進(jìn)行分類。

圖6 不同區(qū)域柴胡樣品化合物的PCA雙標(biāo)

3.3 不同產(chǎn)地柴胡樣品氣味與化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)分析

為研究柴胡產(chǎn)生氣味的化學(xué)成分和電子鼻傳感器之間的感應(yīng)機(jī)制，對(duì)17 種成分（顯著差異成分、特有成分）和12 根傳感器的數(shù)據(jù)做PLS 雙標(biāo)圖分析（圖7）。由PLS 圖和電子鼻載荷圖可以發(fā)現(xiàn)，S11、S7、S8、S12、S9、S10 強(qiáng)相關(guān)，S2、S3、S4、S5、S6 強(qiáng)相關(guān)。在PLS 雙標(biāo)圖上電子鼻和化合物距離越近，代表其相關(guān)性越強(qiáng)。結(jié)合顯著性差異成分PCA圖，山西柴胡C11、C42、C43、C63 主要和傳感器S11、S7、S8、S12、S9、S10 相關(guān)，內(nèi)蒙古柴胡C9、C14、C16、C47、C75 主要和傳感器S2、S3、S4、S5、S6 相關(guān)，黑龍江柴胡C5、C7 主要和傳感器S1 相關(guān)。結(jié)合雷達(dá)圖，電子鼻響應(yīng)值差異主要集中在S7～S12 傳感器，因此，區(qū)分18 批柴胡氣味差異的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是C11（2-正丁基呋喃）、C42（1-戊醇）、C43（己醛）、C63（2-辛酮）。

圖7 18批柴胡樣品中17種成分與電子鼻12個(gè)傳感器相關(guān)性的雙標(biāo)圖

4 討論

電子鼻技術(shù)是一種敏感性高、選擇性強(qiáng)的高效、綠色檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)電子鼻技術(shù)除了在白酒[14]、茶葉[15]等方面應(yīng)用較多外，在中藥基原[16]、產(chǎn)地[17]、生長(zhǎng)年限[7]、采收時(shí)間[7]及炮制方式[18]等方面也得到了應(yīng)用。而來(lái)源于傘形科柴胡屬的北柴胡中含有多種揮發(fā)油類成分，是其具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。本研究利用電子鼻對(duì)采自山西、黑龍江及內(nèi)蒙古自治區(qū)的柴胡樣品氣味進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)PCA和LDA兩方式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)晉南柴胡在各個(gè)象限都有分布，晉北柴胡分布在一、二象限，黑龍江柴胡分布在三、四象限，內(nèi)蒙古柴胡分布在第二象限，故PCA 并不能很好地區(qū)分不同產(chǎn)地的柴胡樣品。在PCA 的基礎(chǔ)上，對(duì)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行LDA，發(fā)現(xiàn)利用LDA 可以將采自不同產(chǎn)地的柴胡樣品進(jìn)行區(qū)分。因此，對(duì)不同藥材利用電子鼻進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同藥材的情況選擇合適的數(shù)據(jù)分析方法。利用HS-GC-MS 檢測(cè)不同產(chǎn)地柴胡樣品的揮發(fā)性成分，共得到76 個(gè)成分，主要包括烷烴、烯烴、醇、醛、酮、酯、芳香、胺及羧酸類成分。應(yīng)用SIMCA 14.0 軟件對(duì)不同產(chǎn)地?fù)]發(fā)性成分進(jìn)行分析，VIP＞1的成分共有11個(gè)，主要存在于芳香、醛、醇、胺、烯烴類等成分中，是區(qū)分不同產(chǎn)地柴胡的主要成分，且利用PCA 對(duì)不同產(chǎn)地柴胡樣品的HSGC-MS數(shù)據(jù)所得的結(jié)果與利用LDA對(duì)柴胡電子鼻數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致。雷達(dá)圖中各批柴胡樣品電子鼻響應(yīng)值差異主要集中在S7～S12 傳感器，結(jié)合PLS 雙標(biāo)圖，區(qū)分18 批柴胡氣味差異的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是己醛、1-戊醇、2-辛酮、2-正丁基呋喃。18 批柴胡中揮發(fā)性成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是己醛（13.98%～78.17%）。葉耀輝等[20]GC-MS 分析柴胡不同炮制品的揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)己醛是各炮制品共有成分中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的，己醛可能是柴胡發(fā)揮藥理效用重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。香氣是柴胡的一個(gè)重要特征，可以通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估正己醛是否可以作為一個(gè)評(píng)價(jià)柴胡質(zhì)量的指標(biāo)性成分。

本研究顯示利用電子鼻可以區(qū)分不同產(chǎn)地的柴胡樣品，并采用HS-GC-MS 對(duì)不同產(chǎn)地柴胡樣品氣味電子鼻響應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，為以揮發(fā)油為主要活性成分的柴胡氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)與傳感器反應(yīng)之間的機(jī)制解析提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為電子鼻在柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)上的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。