食品組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂膠成分鑒定

張文文 趙溪 張旭光,3,4 王凱 李強(qiáng)強(qiáng) 薛曉鋒 吳黎明

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，100093；2 湯臣倍健股份有限公司科技中心；3 中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所，200000；4 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，518000）

1 蜂膠概述

蜂膠是蜜蜂采集外界多種樹(shù)木的嫩芽分泌物或樹(shù)木受傷部位分泌的樹(shù)脂、泥土砂礫、蜜蜂蜂蠟以及蜜蜂的腺體分泌物混合形成的。通常，蜂膠是由50%～60%的樹(shù)脂和香脂，30%～40%的蠟、5%～10%的精油、5%的花粉粒、微量元素和維生素組成[1]。在蜂巢中，被蜜蜂用來(lái)建造和修補(bǔ)巢穴、光滑巢壁、填補(bǔ)縫隙和抵御外界病原菌，防止微生物疾病的發(fā)生與傳播及蟲(chóng)鼠的入侵，同時(shí)蜂膠作為一種天然產(chǎn)品受到廣泛應(yīng)用和關(guān)注。

1.1 蜂膠的化學(xué)成分

蜂膠有著十分復(fù)雜的化學(xué)成分，由上百種化合物組成，大量研究表明，不同植物源、蜜蜂所在當(dāng)?shù)貧夂虻牟煌⒉赡z的時(shí)間以及蜜蜂種類(lèi)的不同都會(huì)導(dǎo)致蜂膠的成分組成差異，隨著現(xiàn)代分離、純化以及鑒定技術(shù)的發(fā)展，如核磁共振（NMR）、氣相色譜（GC）、薄層色譜、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等，蜂膠中的化學(xué)成分被逐漸挖掘和發(fā)現(xiàn)，蜂膠中的主要成分有黃酮、酚酸、萜類(lèi)、芳香酸、醇類(lèi)、脂肪酸、礦物質(zhì)、類(lèi)固醇和糖等，其中酚酸和黃酮是蜂膠的主要活性組成成分，其含量的高低決定了蜂膠的質(zhì)量[2]。

蜂膠中的黃酮化合物根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同又可以分成11 個(gè)亞類(lèi)，即黃烷、異黃烷、黃烷酮、黃烷醇、黃酮、異黃酮、異二氫黃酮、黃酮醇、查耳酮、二氫查耳酮和新黃酮。萜類(lèi)使蜂膠具有特殊的樹(shù)脂氣味，是蜂膠中的主要揮發(fā)性成分，也是蜂膠中有效活性成分，因此也可以以此來(lái)簡(jiǎn)單的區(qū)分優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì)蜂膠以及假蜂膠，約占蜂膠總量的10%。蜂膠中分離出的萜類(lèi)包括單萜、倍半萜、二萜和三萜類(lèi)，其中單萜又分為無(wú)環(huán)、單環(huán)、二環(huán)單萜及其衍生物。倍半萜是蜂膠萜類(lèi)中含量最豐富的，根據(jù)環(huán)的數(shù)量，倍半萜分為四類(lèi)：無(wú)環(huán)，單環(huán)，雙環(huán)和三環(huán)[3]。脂肪酸是蜂膠中的非極性部分之一，以糖苷，游離脂肪酸，不同類(lèi)型的酯或其他形式存在于蜂膠中[4]。蜂膠中還含有蔗糖、果糖、葡萄糖等糖類(lèi)物質(zhì)，蜂膠中糖類(lèi)的來(lái)源問(wèn)題目前尚未得到徹底解決，有研究認(rèn)為，蜂膠中的蔗糖、果糖和葡萄糖可能來(lái)源于蜂蜜或者蜜蜂采集的花蜜，還有研究認(rèn)為，蜂膠中的糖可能是由蜂膠中的類(lèi)黃酮糖苷分解產(chǎn)生的[5]。Cvek 等通過(guò)中子活化分析在不同的阿根廷蜂膠中鑒定出了Br、Co、Cr、Fe、Rb、Sb、Sm 和Zn[6]。

1.2 蜂膠的生物活性

據(jù)報(bào)道，蜂膠早在公元前300年就被世界許多地區(qū)的人們所發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中[7]。埃及人發(fā)現(xiàn)并利用了蜂膠的抗氧化和抑菌活性，用蜂膠來(lái)保存已故的尸體。到了中世紀(jì)，阿拉伯人用蜂膠來(lái)抑制傷口感染和作為口腔消毒劑[8]。

蜂膠復(fù)雜的化學(xué)成分組成與蜂膠的多種生物活性息息相關(guān)。蜂膠中肉桂酸和香豆素的存在產(chǎn)生殺菌作用，由于類(lèi)黃酮和芳香酸衍生物的作用，蜂膠具有體外抗病毒活性（單純皰疹，流感）、抗?jié)儯◣椭希⒚庖叽碳ぁ⒔祲汉鸵种萍?xì)胞等作用[9]。蜂膠中所含有的阿替匹林C、綠原酸、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、高良姜素、槲皮素以及黃酮等化合物都是具有強(qiáng)大的治療潛能[10]。許多科學(xué)研究也報(bào)道了蜂膠的生物活性，有抗炎癥[11]、抗腫瘤[12]、抗癌癥[13]、抗真菌[14]、清除自由基[15]、免疫刺激等。蜂膠在生活中的多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域都有應(yīng)用，包括醫(yī)學(xué)、保健品、化妝品等。

2 食品組學(xué)概述

近年來(lái)，食品組學(xué)研究取得了飛速的發(fā)展，這主要體現(xiàn)在先進(jìn)的研究技術(shù)中，使食品組學(xué)的方法學(xué)研究在多個(gè)領(lǐng)域更加通用。食品組學(xué)研究可以用來(lái)分析食品的生物活性和食品中的活性成分、提供相關(guān)分子機(jī)制的新見(jiàn)解、探索和發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記[16]。

2.1 基因組學(xué)

基因組學(xué)在食品組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用較早，涉及生物體內(nèi)基因組基因的結(jié)構(gòu)和功能基因的測(cè)序、組裝和分析。基因組學(xué)的主要目的是為了了解生物學(xué)的組成部分，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)和分析獲得盡可能多的與生物學(xué)組成相關(guān)的遺傳序列信息。基因組學(xué)研究所使用的技術(shù)中，用途最廣泛的是高密度寡核苷酸或互補(bǔ)DNA 陣列技術(shù)。與DNA陣列技術(shù)相比，下一代DNA測(cè)序技術(shù)（NGS）可以同時(shí)（通常也叫做盡可能平行）處理數(shù)百萬(wàn)個(gè)測(cè)序反應(yīng)，且無(wú)需序列庫(kù)[17]，大大提高了DNA 序列信息獲取的速度，并降低了測(cè)序成本。基因組學(xué)技術(shù)還包括單分子測(cè)序（也稱為第三代測(cè)序系統(tǒng)），單分子測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于允許高密度單分子異步擴(kuò)展，因此在化學(xué)動(dòng)力學(xué)方面具有高度的靈活性[18]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對(duì)一個(gè)細(xì)胞或者一組細(xì)胞的所有RNA 信息進(jìn)行的研究，是了解基因組功能元件并揭示細(xì)胞分子組成的重要工具[19]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的兩個(gè)主要工具分別是基因表達(dá)微陣列和RNA 大規(guī)模測(cè)序（RNA-Seq）。基因表達(dá)微陣列根據(jù)其設(shè)計(jì)可分為在固體平板基質(zhì)（或微芯片）上的微陣列和在球形基質(zhì)（或顆粒微陣列）上的微陣列[20]。RNA-seq 技術(shù)是基于新一代測(cè)序技術(shù)，并且有大量的測(cè)序平臺(tái)，其目的是對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行測(cè)序[21]，因此RNA-seq 技術(shù)可以應(yīng)用于全基因組高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

食品蛋白質(zhì)組學(xué)是指以應(yīng)用食品蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)特定生物食品系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模分析，除了研究蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能外，蛋白質(zhì)組學(xué)還研究蛋白質(zhì)的修飾作用，蛋白質(zhì)豐度的定量分析以及研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[22]。蛋白質(zhì)組學(xué)還致力于在特定時(shí)間和條件下，對(duì)生物系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析過(guò)程包括蛋白質(zhì)的提取和分離，蛋白質(zhì)消化成肽，質(zhì)譜分析，蛋白質(zhì)的定性和定量分析[23]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析中有兩種蛋白質(zhì)提取和分離技術(shù)，一種是二維電泳（2-DE）法，另一種是多維液相色譜法。2-DE 方法中蛋白質(zhì)的提取和分離是基于等電點(diǎn)（pI）和在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分離，然后進(jìn)行圖像分析以對(duì)圖像中所有可辨別的斑點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)，以為后續(xù)研究提供參考[24]。多維液相色譜技術(shù)可以通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的LC（LC-MS/MS）進(jìn)行蛋白質(zhì)的有效提取和分離。用來(lái)表征和分析蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的工具主要是質(zhì)譜分析，包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間（MALDI-TOF）和電離子阱質(zhì)譜（ESI-IT），這兩種技術(shù)都是先將蛋白質(zhì)電離，然后再通過(guò)MS 分析[25]。

2.4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)技術(shù)專注于小分子代謝物（＜1000-1500Da）的定性和定量研究，以比較樣品之間的差異[26]。代謝組學(xué)分析的內(nèi)容包括根據(jù)研究目的提取目標(biāo)代謝物，選擇分析儀器和準(zhǔn)備樣品，進(jìn)行樣品上機(jī)檢測(cè)，獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果以及通過(guò)分析軟件進(jìn)行分析和鑒定，生物信息學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)是兩種主要用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析的工具[27]。代謝組學(xué)的研究有靶向和非靶向兩種方法，其中非靶向代謝組學(xué)又包括代謝譜和代謝指紋圖譜。代謝組學(xué)技術(shù)中最常用的數(shù)據(jù)采集平臺(tái)有核磁共振（NMR），氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS），液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS） 和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法（CE-MS）[28]。不同的組學(xué)技術(shù)分析各有其優(yōu)勢(shì)，各種代謝組學(xué)技術(shù)的組合應(yīng)用可以獲得互補(bǔ)的分析信息結(jié)果，從而使代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍更廣。

2.5 其他

食品組學(xué)還包括化學(xué)計(jì)量學(xué)，表觀基因組學(xué)，生物信息學(xué)和MicroRNA（miRNA）等。化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)是代謝組學(xué)技術(shù)的一個(gè)分支，通過(guò)構(gòu)建模型來(lái)識(shí)別和驗(yàn)證目標(biāo)樣品，識(shí)別和分類(lèi)的方法主要包括非監(jiān)督主成分分析（PCA），監(jiān)督判別分析（DA），層次聚類(lèi)分析（HCA）和類(lèi)模擬的軟獨(dú)立建模（SIMCA）[29]。表觀遺傳學(xué)技術(shù)是指在表觀遺傳學(xué)水平上對(duì)基因狀態(tài)變化進(jìn)行全基因組分析[30]。全基因組分析主要是分析染色體的染色體結(jié)構(gòu)變化，該染色體結(jié)構(gòu)會(huì)影響相應(yīng)基因的表達(dá)，從而影響相應(yīng)位置的表觀遺傳狀態(tài)[31]。生物信息學(xué)技術(shù)是對(duì)從各種組學(xué)技術(shù)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入探索，并通過(guò)功能注釋，遺傳和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，最后闡述其生物學(xué)意義[32]。miRNA 是非編碼RNA 的亞型，可通過(guò)mRNA 降解，mRNA 翻譯和基因轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[33]。

3 食品組學(xué)技術(shù)在蜂膠成分研究中的應(yīng)用

食品組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂膠研究可以快速精確地對(duì)蜂膠的生物學(xué)來(lái)源、產(chǎn)地、類(lèi)別以及蜂膠的化學(xué)成分、蜂膠的質(zhì)量控制等進(jìn)行有效的分析。Wang 等應(yīng)用了一種可靠的基于1 H NMR 的代謝組學(xué)方法深入了解中國(guó)溫帶蜂膠（CWTP）和中國(guó)中溫蜂膠（CMTP）的成分差異，共收集了63 個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的相同植物源的中國(guó)蜂膠乙醇提取物進(jìn)行分析，鑒定出21 種化合物，包括10 種類(lèi)黃酮，9 種酚酸及其酯以及其他化合物，且研究發(fā)現(xiàn)，由于蜜蜂對(duì)相同植物來(lái)源所在不同氣候地區(qū)的長(zhǎng)期適應(yīng)，造成了蜂膠的成分差異，并造成了蜂膠生物活性的差異[34]。Mouse 等通過(guò)HPLC/ESI-MS 研究了摩洛哥蜂膠提取物的化學(xué)成分，以及它們?cè)隗w內(nèi)和體外的抗癌潛力，結(jié)果表明，摩洛哥蜂膠提取物中含有幾種黃酮類(lèi)化合物，包括鼠李素，木犀草素和三氫西甲氧黃酮，一些類(lèi)黃酮苷，如漢黃芩苷，槲皮素阿拉伯糖苷和山奈酚-O-葡萄糖苷，其抗癌活性不僅取決于蜂膠提取物所含有的化學(xué)成分，還取決于靶向的腫瘤細(xì)胞[21]。使用基于GC-MS 方法，Duran 等人研究?jī)煞N土耳其蜂膠提取物的化學(xué)成分與抗利什曼蟲(chóng)藥活性之間的關(guān)系，研究確定了提取物中的化合物，包括一些脂肪酸酯（油酸乙酯），肉桂酸酯（肉桂酸肉桂酸酯），碳?xì)浠衔铮ㄊ咛枷?-十七碳烯和1-十八碳烯）和倍半萜烯（δ-cadinene），這些化合物有助于土耳其蜂膠提取物具有對(duì)抗利什曼原蟲(chóng)的功效[22]。Barbaric 等通過(guò)RP-HPLC 鑒定并定量了20種乙醇提取的蜂膠樣品中的酚酸和類(lèi)黃酮，分別是阿魏酸、對(duì)香豆酸和柯因、高良姜素、芹菜素、松屬素-7-甲醚、松屬素、山奈酚[9]。Soltani 等應(yīng)用GC-MS 檢測(cè)技術(shù)基于峰面積和保留時(shí)間（RT）檢測(cè)了四種來(lái)自阿爾及利亞塞提夫地區(qū)的蜂膠的化學(xué)成分，結(jié)果在水提取物和乙醇提取物中分別鑒定出20 多種化合物和30 至35 種化合物[11]。Okinczyc 等研究尼泊爾地區(qū)源于Apis mellifera L.和Trigona sp的兩個(gè)蜜蜂屬的蜂膠，通過(guò)HPLC-DAD-MS/MS 技術(shù)鑒定70%乙醇提取后提取物的化學(xué)成分，共檢測(cè)出23 種化學(xué)成分，兩種蜂膠提取物的成分幾乎相同，主要成分為黃酮（主要是新類(lèi)黃酮，異類(lèi)黃酮）和紫檀素[12]。Ristivojevi? 等利用UHPLC-LTQ/Orbitrap/MS/MS 技術(shù)研究土耳其蜂膠中的化學(xué)成分，結(jié)果共定性定量了15 種化合物，包括2 種苯甲酸衍生物、5 種酚酸和3 種黃烷醇，3 種黃酮，1 種黃烷酮和1 種糖苷[13]。蜂膠中的酚酸和黃酮成分是其主要的生物活性成分，但是蜂膠中的酚酸黃酮的種類(lèi)和含量受到當(dāng)?shù)貧夂蚝椭参镌吹挠绊懘嬖谳^大差異，Safti? 等建立了與三重四極桿結(jié)合的目標(biāo)液相色譜法（LC-QQQ），與四極桿飛行時(shí)間結(jié)合的非靶向液相色譜法（LC-QTOF）和直接進(jìn)樣QTOF 法，分析了來(lái)自克羅地亞不同地理區(qū)域的56種蜂膠樣品。分析結(jié)果表明，克羅地亞境內(nèi)不只一種蜂膠類(lèi)型，主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）表明，蜂膠樣品中的多酚含量在地中海的影響下發(fā)生了顯著變化，因此，在克羅地亞海岸，“歐洲”蜂膠類(lèi)型與地中海型蜂膠混合，尤其是在島嶼上。對(duì)于蜂膠類(lèi)型的快速篩查，直接進(jìn)樣QTOF 分析被證明是一種快速可靠的方法，但是對(duì)于酚類(lèi)化合物的明確鑒定，色譜分離是必不可少的[35]。

4 總結(jié)

食品組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用于蜂膠研究，多是體現(xiàn)在對(duì)蜂膠成分、蜂膠的類(lèi)別、蜂膠的起源地的鑒定，對(duì)于蜂膠的活性及機(jī)制研究的應(yīng)用還比較少。因此，食品組學(xué)技術(shù)可以繼續(xù)應(yīng)用于蜂膠的活性研究，并從基因、蛋白、代謝通路等多個(gè)方面探究其主要活性成分和作用機(jī)制。