組學技術在推拿學科中的應用與芻議*

李華南，張瑋，馬菲，包安，陳英英，王海騰，王建伍，董樺，王金貴

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院推拿科，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；2.國家中醫藥管理局推拿手法生物效應三級實驗室，天津 300193；3.天津市中醫藥研究院附屬醫院科研處，天津 300120）

組學技術作為系統生物學中的一部分，近年在中醫藥研究中應用備受關注[1]。其從人體的有機整體角度出發，通過對基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學數據進行整合分析，可以了解目標樣本內基因、RNA、蛋白質和代謝產物的基本狀態，從而對生物系統進行全面解讀[2]。該技術具有整體性和動態性的特點。

推拿療法作為中醫藥學的重要組成部分，近年來隨著中醫藥熱的重新興起，逐漸被大眾認可與接收。但是限于研究手段的局限，其作用機制尚未被充分揭示，這也極大的阻礙了中醫藥的發展。現有的大量研究表明，推拿作用于人體后，除了施術局部的變化以外，還會通過多環節、多層次、多靶點、多維角度對受術者進行整體調節。這與組學技術的優勢特點有很大一致性，符合推拿研究需要。未來是否可以借助組學技術從全局的角度揭示推拿的調節機制，值得學界的深入思考。特別是有望為推拿的臨床治療效果研究提供更符合機體實際情況的證據，為推拿的基礎研究提供指引和參考，揭示推拿現代科學內涵。文章結合組學技術的基本知識，對推拿療法的現有研究進行綜述，并分析策略與技術及在推拿關鍵科學問題研究中的應用現狀等進行分析與論述。

1 組學技術在推拿學科中的應用

1.1 代謝組學 代謝組學是系統生物學的重要組成部分之一，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等技術逐漸形成的新興研究方法[3-4]。代謝組學可以針對細胞、生物流體、組織或生物體內的小分子進行大規模的觀測，研究生物體受到刺激、干預后其代謝產物種類、數量及變化規律，并進行定量分析，以此分析研究對象的病生理狀態[5]。目前行業內被廣泛應用的代謝組學分析技術主要有：核磁共振技術（NMR）、氣相色譜與質譜共用技術（GC-MS）、液相色譜與質譜共用技術（LC-MS）[6]。

戴七一等[7]應用1HNMR觀察特色揉髕手法對兔膝關節骨關節炎模型血清代謝組學的影響。結果顯示，乳酸鹽濃度手法組在各組中最高；葡萄糖、甘氨酸濃度手法組在各組中最低。提示揉髕手法的作用可能與上述代謝物有關。張紅石[8]應用NMR觀察腹部推拿對心脾兩虛型原發性失眠患者下丘腦腦代謝產物N-乙酰天門冬氨酸、肌酸/附加肌酸、膽堿復合物、肌醇的影響。結果顯示推拿治療后，患者下丘腦區N-乙酰天門冬氨酸較治療前降低明顯，膽堿復合物有下降趨勢。同時，經過對腦代謝物比對，篩選了24種差異代謝物，并通過差異性代謝通路圖。提示腹部推拿干預失眠可能與下丘腦中的N-乙酰天門冬氨酸含量變化及甘氨酸通路促眠作用有關。

楊丹[9]利用LC-MS研究了太極推拿改善頸痛大學生癥狀的病理機制，觀察血清蛋白質發生的變化。結果發現，與推拿干預有關的蛋白數量達到49個，上調15個，下調34個。各組差異蛋白參與了23種生物進程，上調蛋白和下調蛋白參與了細胞組分、生物進程、分子功能等。李海曼[10]采用超高效LC-MS研究湘西劉氏小兒推拿對脾虛質兒童糞便差異性代謝物涉及的代謝通路影響，及湘西劉氏小兒推拿對其干預后涉及的代謝通路。結果顯示：湘西劉氏小兒推拿涉及通路主要有天冬氨酸和谷氨酸代謝、丙氨酸、氨基糖和核苷酸糖代謝及磷酸戊糖途徑。汪毅明[11]應用LC-MS觀察不同配穴方式干預功能性消化不良模型大鼠的作用機制。結果顯示，包括蛋白質消化吸收，ABC轉運蛋白，氨酰生物合成，礦物質吸收等重要通路參與了推拿干預進程；而單穴組與配穴組比較，顯示模型大鼠的蛋白質消化吸收，氨酰生物合成等通路在其中起到了關鍵作用。朱騰高等[12]基于現代電噴霧萃取電離質譜技術，在推拿前后采集肝膽火旺、心脾陽虛和寒濕厚重等志愿者的呼出氣體進行樣品指紋譜圖分析。結果腎上腺素、3-（3-羥基苯基）丙酸和L-色氨酸等代謝物發生了明顯變化。說明中醫推拿的干預效果可能與志愿者的新陳代謝有關。

1.2 蛋白組學 蛋白質組學是近年快速發展的一門技術，其在質譜技術基礎上，通過對研究的目標樣品進行處理，從細胞，組織，體液等提取、采集蛋白質進行研究的技術[13]。其中最主要的分支是定量蛋白質組學，該技術廣泛地應用于現代生物學和醫學等的基礎、機制研究中。目前雙向電泳技術和基于質譜的蛋白質定量技術在蛋白質定量技術研究中應用比較成熟[14]。而且，從蛋白質組學的研究思路來看，該技術與中醫藥一直強調的整體觀念、機體統一理論是十分相近的，研究者可以利用質譜技術檢測研究樣品的蛋白質表達情況，篩選中醫藥干預的關鍵蛋白通路，從分子水平解釋中醫藥的干預作用提供新途徑和理論依據[15]。蛋白質是生物生命活動的主要承擔者，生物體細胞增殖、分化、衰老與凋亡的發生、調控過程和大多數藥物靶標均處于蛋白質水平。因此，尋找中醫藥療法干預腰椎間盤突出癥的相關差異表達蛋白，為研究中醫藥的作用機制有著重要的意義。張明順等[16]應用基質輔助激光解吸串聯飛行時間質譜技術篩選出6個差異蛋白點，經質譜鑒定得到AGP α1-酸性糖蛋白、免疫球蛋白α-1鏈C區、未知蛋白3種蛋白質，其中酸性糖蛋白最相關。在推拿干預后該蛋白表達量減少。說明推拿手法可能是改善腰椎間盤突出癥患者突出的神經根局部病變的微環境，減輕了機體的炎癥反應。

1.3 基因組學 基因組學技術也是近年來快速發展起來的一門新興技術，它是由美國遺傳學家Thomas H.Roderick提出并研究形成，該技術廣泛應用于生物體基因表征、定量研究等。特別是在該技術的創新引領下，國內學者也希望通過從基因的表達譜或表達差異角度，研究中醫藥方法干預后發生的基因表達與調控規律，探索其內在干預機制[2]。何琪等[17]以質譜檢測法和焦磷酸測序法檢測各組海馬組織內白細胞介素-10（IL-10）DNA和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）甲基化水平。結果顯示實驗組、空白組與模型對照組3組間IL-10DNA啟動子區域甲基化水平差異無統計學意義，TNF-α基因啟動子區域甲基化實驗組明顯優于模型對照組，差異有統計學意義。提示推拿的起效機制可能與腦癱模型大鼠腦內TNF-α基因表達有關。

1.4 轉錄組學 轉錄組學能夠從整體水平研究特定條件下細胞中基因的轉錄情況及其調整規律。這一研究思路和中醫用藥整體觀的指導思想不謀而合。中醫藥疾病的治療中，不但會對人體的組織器官產生影響，而且也會對機體RNA的表觀表達產生影響。轉錄組學技術可以實現在復雜干預信息影響下，分析中醫藥療法在混雜作用條件下，各作用靶點之間互相關聯、協同發揮作用。多角度研究中醫藥的作用，從整體水平上研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發生過程中的分子機理。呂桃桃[18]利用RNA-Seq技術探究三法三穴對坐骨神經損傷（SNI）大鼠的神經傳導通路關鍵部位基因表達影響，從轉錄組水平闡明推拿對周圍神經損傷的恢復機制。結果顯示：對SNI模型大鼠脊髓背角神經細胞測序，三法三穴組KEGG通路富集在生物調節、對刺激積極應對、參與化學突觸傳遞等；京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集在Wnt信號通路、IL-17信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。而脊髓背角、腹角測序，三法三穴組基因本體（GO）功能富集在信號調節、突觸部分、信號轉導調控、細胞分化調控等有關，KEGG通路富集在MAPK信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號通路等，與免疫系統、癌癥、信號轉導等通路密切相關。腓腸肌測序，顯示KEGG通路富集在細胞因子-細胞因子-受體相互作用、AMPK信號通路等。他們認為推拿對神經損傷大鼠的修復，可能是通過降低背根神經節（DRG）中的Pdzd2、Camk2a、Mdk、Clq13、Klf7等基因表達，促進SNI大鼠的軸突再生、感覺和運動功能的恢復。這些基因可能成為推拿促進周圍神經損傷修復的重要治療靶點。

2 應用組學技術開展推拿學科關鍵問題研究可望取得明顯進展

2.1 推拿優勢病種、重大疾病效應機制研究 推拿臨床應用廣泛，特別是在消化系統、內分泌系統疾病的防治中作用明顯[19-21]。近年來，《中醫藥法》《中醫藥發展“十三五”規劃》《“健康中國2030”規劃綱要》和《關于加快中醫藥特色發展的若干政策措施》先后頒布，中醫藥在新型冠狀病毒肺炎疫情防治中的重要貢獻，均提振了中醫藥在國家衛生健康戰略中的地位與作用。推拿作為中醫藥的特色療法與技術之一，在其中正發揮著重要作用。應用組學技術，一方面可以明確推拿在糖尿病、營養不良、肥胖等疾病中的優勢，同時也可以更加深入、廣泛、動態的層面上探索推拿治療上述疾病的效應機制，對于鞏固中國推拿在國際上的地位，爭取推拿為代表的中醫藥療法在國際社會中的話語權以及認同感都將起到積極作用。

2.2 推拿腧穴配伍規律研究 腧穴配伍是針灸推拿學科發展過程中必須要思考的重點科學問題。特別推拿領域，針對于臟腑推拿、小兒推拿，腧穴配伍是推拿醫生取得良好臨床療效的基礎，能夠合理的選取最佳腧穴進行配伍是推拿臨床醫家關注的重要理論問題[22]。目前，在推拿的臨床研究中，可以看到腧穴配伍形式多樣，以臟腑推拿為例：多數是按部配伍和按經配伍，小兒推拿則主要以部位與穴性配伍。在配伍過程中，穴位、部位的結合可以產生特異性治療功效。因此，研究腧穴配伍，特別是其中的科學道理是未來是提高推拿療效的關鍵。圍繞腧穴配伍，目前推拿還沒有進行相關組學研究。但與之相近的針灸學科已經有了開端。有研究[23]應用代謝組學技術圍繞俞募配穴法對功能性消化不良大鼠血清代謝物進行研究。結果顯示，電針“胃俞”與“中脘”穴可以使高密度脂蛋白和N-乙酰糖蛋白含量明顯增高，極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白含量減少，這表明俞募配穴可能從代謝水平促進了大鼠機體內血脂代謝，促進胃動力恢復。而未來推拿學科是否可以圍繞小兒推拿的核心特定穴的優化組學以及臟腑推拿的腧穴配伍進行相關研究，值得從業者的思考，也希望能引起學界共鳴。

2.3 推拿量效關系研究 量效學是中醫外治療法的重要研究內容，如何發揮量效的最優值，真正實現事半功倍，一直是學界的重點研究。推拿手法的量效關系是目前推拿學研究的重要方向，無論是手法的力學大小、兩次治療時間間隔研究、最優化治療療程等因素均屬于推拿量效研究范疇。針對手法量效關系，對其內在的機制以及最有效進行闡述和研究，是推拿學科的重要課題[24]。多數課本對手法操作的頻率和次數有要求以外，對手法的作用力度和時間沒有做出確切的要求和規定。這也導致了手法應用上的誤區，許多臨床醫生常以藥物治療的規律來看待手法療效。當推拿治療效果欠佳時，常以加大手法刺激強度、延長治療時間、增加關節被動運動幅度來尋求提高效果，這是一種簡單機械的思維模式，在臨床手法操作時是不可取的。

而組學技術的產生與發展也為推拿量效研究提供了研究基礎，如果臟腑推拿在調節糖尿病患者的治療過程中，應用代謝組學觀測患者的代謝產物變化，是否能夠更加明確、更加快捷的顯示推拿的治療效果？也能更好的揭示其作用機制。對于小兒推拿來說，針對于咳嗽、便秘、過敏性鼻炎、哮喘等疾病的患兒，小兒推拿的推拿治療可以改善他們的癥狀、自身免疫反應等，而這其中研究者能否應用組學技術觀察小兒推拿對于患兒表觀遺傳的影響？種種想法，都能夠體現現代科技與推拿結合進行的量—效關系研究，以力學、時間等因素為切入點進行研究，從微觀層次研究推拿量—效關系研究，以期推拿手法治療走向量化，中醫推拿操作更加標準化、規范化，并為相關研究提供參考。

2.4 推拿臨床教學研究 推拿既是一門學科也是一門技能，它的學習是一個復雜的心理過程，它包括3個關鍵的環節，即技能知識理解環節、技能的練習和熟練環節，技能的鞏固和發揮環節。在其中產生推拿的療效關鍵一方面在量效，另一方面與手法自身的操作。以行業耕耘30年的專家與初入行的初學者，二者最大的區別不在于手法的操作，而在于手法的體會、是否更具深透性，以及最大有效做功傳入。方磊等[25]學者探討了基因組學與蛋白質組學技術對未來推拿手法研究的意義，他們認為在現代推拿手法的臨床研究中，可以借助基因組學與蛋白質組學手段來闡釋與表達手法的量效問題，觀察專家手部基因表達，基因間、基因與基因產物間以及基因產物間的相互作用及信號傳導通路和網絡發生的變化。從研究中進一步篩選出差異蛋白，進而能夠準確找到推拿從業者中初級與專家的手法區別。為提供推拿手法教學的標準化、客觀化提供新的研究思路與內容。同時，亦可以在教學研究中，應用組學技術觀察手法操作過程中受試對象的大腦代謝產物變化。

3 討論

推拿的作用機制是非常復雜的過程，它是將機械信號、壓力信號等逐漸轉化為人體生物信號的過程，可能涉及生物力學改變、神經卡壓、自身免疫、局部炎癥細胞因子聚集等多方面、多環節原因。目前，推拿的作用機制研究還主要圍繞單一方向展開研究。如：學者呂立江教授通過腰椎三維有限元建模方法,研究平面力推拿揉法對腰椎間盤生物力學的影響[26]，應用三維分割與模型重建等技術，觀察揉法作用后纖維環及髓核的變化。李增圖等[27]借助血流動力學指標以及血液流變學參數，觀測推拿對椎動脈的血流影響，探討手法改善椎-基底動脈供血不足的作用機制。海興華等[28]應用酶聯免疫吸附測定法觀察腹部推拿對胃黏膜組織中TNF-α、IL-6和表皮生長因子（EGF）含量的影響，以探討腹部推拿對胃黏膜損傷的修復作用。萬小鳳等[29]應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測腓腸肌中miR-23a、Akt、MuRF1、MAFbx 基因相對表達量，探討推拿對失神經骨骼肌萎縮大鼠的治療作用及其機制。李華南等[30]應用鈣離子熒光探針技術觀察腹部推拿對腸平滑肌細胞鈣離子（Ca2+）濃度影響，以此觀察推拿手法對結腸動力的影響。這些研究雖然均是圍繞著推拿的作用機制展開，但是往往是針對某一指標，某一通路，或者是某一基因位點。

就推拿而言，它的作用機制是多維度。那么單一研究勢必存在著固有的弊端，即考慮機制缺乏全面性。比如：推拿治療膝關節骨性關節炎過程中，如果單純只考慮手法改善膝關節內環境、延緩內部炎癥，那么思路就過于表淺，這是因為手法還能改善膝關節周圍肌肉力學平衡，改善下肢生物力學離線。因此，推拿恰是由于其作用機制存在廣泛性、多靶點的特點，學界往往很難全面概述推拿的作用機制。因此，學界的研究者們也在尋求某種技術能夠解決這方面的問題。組學技術的產生與發展，讓這種設想逐漸成為了現實。組學技術的整體性、統一性，與中醫藥的作用特性高度契合，上述技術也可以及時觀測推拿在防治疾病的干預過程，特別是針對患者或者模型的機體代謝物、蛋白變化發現差異，進一步明確推拿技術起效中的特異性靶點，闡明推拿起效機制提供依據。

通過文獻研究發現了推拿學科當前圍繞組學研究的不足，目前在推拿學科的大部分組學研究僅限于蛋白檢測和代謝產物的變化，從基因層面、轉錄組學等進行更加深入的機制研究相對較少。這值得學界研究者思考，一方面這些新技術的特點是什么，是否對推拿學科的研究領域還有空白？另外，未來研究者能否聯合上述技術，不單單局限于一個水平或者一方面，而是借助組學技術的融合特點，從多角度、多技術性開展研究，合理整合、科學分析，進一步系統深入地揭示推拿在防治優勢病種過程中的物質基礎和作用機制？除此之外，還要充分考慮組學研究的不足，特別是中一些非實驗性因素對結果有較大干擾，如患者的性別、年齡、飲食條件、健康狀態等，基礎實驗中的動物品系、溫度、干預方法的操作標準不統一等影響因素[31]，均可影響生物體的代謝產物等變化，這也為數據的分析帶來一定的難度。因此，組學技術與推拿學科的結合，繼續要不斷的進行實驗探討，同時還有很長的一段路要走，相信未來伴隨現代科學的發展與探索，組學勢必為推拿的臨床與基礎研究提供新的技術平臺。