光遺傳學在中樞神經系統疾病治療中的應用

班德翔 向振洋 劉 洋 曹富江*

（天津醫科大學總醫院骨科，天津 300052）

光遺傳學（optogenetics）這一概念于2006年首次被提出[1]，以其毫秒級精準的時間和空間精度的優勢廣泛地運用于神經科學的各個領域，從探索單個突觸的屬性到研究神經回路內和跨神經回路的特定神經細胞群體，再到操作復雜的行為。Thompson和Towne[2]于2016年將光遺傳學定義為一種使用光控制活體組織中細胞的方法，表達光敏蛋白的神經元細胞尤為典型。光遺傳學技術為精確控制細胞功能提供了可能性，相關技術使對蛋白質功能調控、信號通路激活及動物行為的時空精確控制成為可能，為研究神經回路及信號網絡提供了獨特的方法。近幾年，光遺傳學技術在中樞神經系統疾病病理生理機制及相關的治療上的研究尤為突出。中樞神經系統疾病傳統的治療方案，如藥物治療、腦深部刺激（DBS）和手術治療中，存在藥物作用緩慢，不良反應多；腦深部刺激（DBS）有創，缺乏細胞類型特異性，需要永久植入電極[3]；手術治療無法精準地定位特定病變腦區等一系列缺點。而光遺傳學因其具有非侵入性，可以精確地定位，具有精準的時間和空間精度，可以在多個波長和位置同時使用，以及具有顯示特定神經元及神經元群體存活和特定分子的活性的優勢，因而越來越多的運用于中樞神經系統疾病的機制和相關治療的研究中。因此，本篇綜述主要集中在介紹光遺傳學技術的基本原理和最近幾年技術最新的進展，及其在中樞神經系統疾病（如難治性癲癇、帕金森等）的機制研究和治療方面的應用進展。

1 光遺傳學技術

光遺傳學技術是一項光學和遺傳學相結合的開拓性技術，廣泛運用于對特定神經元及神經回路的研究。通常涉及3個核心特征：①視蛋白，可對光做出反應，直接引起跨細胞膜的電流。②將足夠強和特異的視蛋白基因表達定向到大腦中定義明確的細胞元件的一般方法。③在試驗對象進行感興趣的行為時，將足夠強的和精確定時的光刺激送達到特定大腦區域或細胞的一般方法[4]。

1.1 視蛋白及變體 視蛋白由視網膜和一種七次跨膜的光敏蛋白組成。視蛋白根據其功能可以分為兩大類：一類是通道視紫紅質（ChR2），其對藍光敏感。在藍光的刺激下，非特異性陽離子通道被打開，各種陽離子（Na+、K+等）進入細胞，導致細胞去極化[5]。另外一類是細菌視紫紅質和鹵視紫紅質（NpHR）。細菌視紫紅質在受到刺激時將H+運送到細胞外，并且鹵代視紫紅質也可以在黃光的刺激下將Cl-向細胞內轉移[6]。它們都可以在不同波長光的刺激下，開放不同的離子泵使細胞超極化，抑制細胞的活動。可以根據試驗目的（激活或者抑制細胞）選用合適的視蛋白。基于光譜的不同，天然視蛋白及其變體也越來越多地被發現。隨著這幾年光遺傳學實驗的井噴式增加，天然微生物視蛋白及變體的缺陷也顯現出來。由于不同波長的光在組織中的穿透和散射方式不同，只有高強度的光才能滿足光遺傳刺激的要求，這也會導致熱量積累和潛在神經元的損傷。所以在過去幾年，一個新的微生物視蛋白家族已經通過基因工程改造迅速發展，以彌補這些限制。如紅光在組織中的被吸收與散射較少，可以將ChR2（光遺傳學中應用最廣泛的視蛋白）的波長刺激峰由藍色改為紅色，以便刺激組織更深區域。光遺傳學技術的需求刺激了視蛋白變體工程改造的發展，也反過來引領光遺傳技術不斷向前。

1.2 視蛋白表達 視蛋白基因轉導是視蛋白表達的基礎。視蛋白的表達需要在細胞基因組中表達基因轉導的視蛋白基因。轉導方式有3種：病毒載體、轉基因、電穿孔[7]。本研究將重點放在使用病毒載體進行神經元轉導，此方法是目前在臨床研究中使用最廣泛且最有效的視蛋白轉導方式。

將病毒載體注入特定的大腦位置以實現光遺傳刺激，通常包括慢病毒（LV）或腺相關病毒（AAV）。這兩種病毒具有不同的特性，在臨床應用中也有相應優缺點。與直徑約為20 nm的AAVs不同，LV更大的顆粒尺寸（100 nm）局限了其可通過胞外空間擴散。相反AAVs顆粒較小，允許進一步擴散，使其能夠在給定的體積內進行轉導[8]。對于AAV9和AAVrh10，另一個優點是它們可以穿過血腦屏障，因此當病毒載體在外周給藥時，大腦神經元可以被轉導。但LV載體具有更大的基因組容量，其最大包裝效率的基因組容量為8～10 kb[9]，這具有重要的特異性和功能意義，因為可以插入更長的基因序列和多個基因。在另一方面，AAV在一定程度上優于慢病毒，這是因為基于AAV的載體保持在表型，而慢病毒載體整合到宿主基因組中[10]。所以，慢病毒載體的表達容易受到周圍染色質的影響，這種整合可能會導致宿主基因的意外中斷。總之，AAVs是人類基因治療及非人靈長類光遺傳學技術中視蛋白基因轉導最常用的載體。

1.3 光刺激 在將合適波長且足夠強的和精確定時的光刺激特定大腦區域或神經元的過程中，光的傳輸也是相當重要且復雜的。一般來說，使用最廣泛的光源是激光或發光二極管，它們需要復雜的電阻和功率傳輸元件，并且通常太大或太重。經典的光傳輸設備包括外部光源、控制器設備、光纖和探頭[11]。因為視蛋白激活所需的可見光能夠被神經組織散射和吸收，所以光遺傳神經調節依賴于植入的裝置來傳遞光學刺激。

在光遺傳學體內試驗中，利用光纖將特定波長的激光，以不同的脈沖持續時間、輻照度和頻率精準地導入到特定腦區激活或抑制腦區的神經元，從而進一步研究特定腦區對動物相關行為的調控機制。

同時可見光的傳遞通常需要將外來裝置侵入性地植入大腦，這不僅損害了相關組織，還增加了感染和缺血的風險[12]。為了克服這些限制，在一些成熟的神經記錄技術（如Utah列陣，Michigan探針，四極管和微絲等）的基礎上，通過探索軟材料和混合材料，設計出多種多功能和柔性光電探測器。如柔性纖維探針，并且能夠在小鼠大腦和脊髓中同時記錄和進行光學神經調節，而不會引發顯著炎性反應[13]。

2 光遺傳學在中樞神經系統疾病治療中的運用

2.1 在癲癇病中的應用 癲癇是一種異質性疾病，由于腦神經元的過度興奮和過度同步，癲癇的特征是反復自發性癲癇發作。這種異常自發放電可對形體活動、認知以及意識產生影響，并導致臨床出現癇性發作。癲癇的特征是大腦中異常的神經活動，最終導致癥狀的反復發作。傳統的治療方案有藥物、手術切除和電刺激。盡管大多數患者能夠使用抗癲癇藥控制癲癇發作，但是患者通常需要終身用藥，這同時也與患者耐受性差的不良反應相關，尤其是需要多種藥物治療的患者[14]。傳統的抗癲癇藥物藥理機制，由于不具有良好的細胞特異性，無法對癲癇神經回路上的特定神經細胞群體發揮針對性作用，因此通常很難通過藥理學方法有效治療。而且對人類癲癇發作的潛在機制不完全了解，更好的治療方法的發現一直滯后。所以急需開發能夠從源頭上治療癲癇病的技術。通常難治性癲癇是局灶性的，最有效的治療方案是切除手術，但其僅適用于少數患者，因為手術切除會帶來神經系統缺陷的風險，如記憶力、語言、運動和視覺障礙等，特別是切除區域位于大腦活動區。另外，與藥物治療或外科手術切除相比，電刺激能對腦部進行更具針對性和可逆性的治療，但僅對病理回路進行有效靶向治療仍然是一個挑戰，治療可能會導致不良的不良反應，如記憶障礙，抑郁加劇或癲癇發作加劇等[15]。因為電刺激對周圍組織的影響不是細胞類型特異性的，并且高度依賴于患者特定的神經解剖結構，這可能很難預測。考慮到潛在的不良反應，更加急需癲癇患者的臨床新療法。

光遺傳學是一種利用光敏離子通道來激活或者抑制特定神經元活動的技術，可以選擇性地調節抑制性或興奮性神經元的行為來改變特定神經元的行為，以防止癲癇發作而不會破壞生理功能。光遺傳刺激激活海馬興奮性細胞中表達的NpHR，將NpHR的表達限制在興奮性神經元中，抑制了癲癇的發作[16]。這些結果在連續運動性癲癇發作活動的體內模型（模擬人類局部癲癇持續狀態）中得以再現。連續運動性癲癇發作在對全身性藥物治療特別有抵抗力，但是在癲癇局灶處激活NpHR抑制了癲癇的發作[17]。這些研究提供了光遺傳學作為治療癲癇的潛力。光遺傳學不僅為我們提供了一種新的治療方法，還為了解癲癇發作的機制和調節癲癇發作活動的網絡提供新的思路。在皮質卒中模型中，用NpHR抑制丘腦皮質神經元可阻止皮質中的尖峰波放電；在邊緣性癲癇模型中，用NpHR抑制興奮性神經元或用ChR2激活中間神經元，抑制海馬癲癇發作[18]。還可以通過光遺傳學刺激相對較遠的結構（如小腦）來調節邊緣性癲癇發作。光遺傳學提供了一種更精確的方式來調節大腦區域內神經元。

近年來，研究報道星形膠質細胞參與了癲癇的發病機制[19]。星形膠質細胞在癲癇發生中的生理病理作用，涉及反應性星形膠質細胞增生、能量供應和代謝紊亂、神經膠質遞質和細胞外離子濃度，以及血腦屏障功能障礙和血流失調。受損的星形膠質細胞功能和能量穩態在癲癇的發病機制中起著關鍵作用。只有當神經元有足夠的能量來源時，才會發生過度的神經元放電。相反，癲癇發作期間的能量消耗是癲癇發作終止的內源性機制。星形膠質細胞通過神經代謝耦合控制神經元能量穩態[20]。利用光遺傳學技術特異性調控皮質星形膠質細胞，探索其在癲癇發病中的作用并發揮治療作用。星形膠質細胞在癲癇發病機制中的谷氨酸穩態與能量代謝方面發揮著重要作用。有研究報道，光刺激會觸發表達ChR2的星形膠質細胞釋放ATP[21-22]。以及可以通過開放非選擇性陽離子通道進一步通過Ca2+依賴性和非依賴性機制釋放谷氨酸。因此，星形膠質細胞通過神經代謝耦合控制神經元能量穩態可能是一種有效的抗癲癇策略。同時，光遺傳學最令人興奮的方面是能夠使用閉環系統，其中植入的EEG設備檢測到癲癇發作的開始，從而觸發發光設備，激活特定類別中表達的視蛋白神經元。閉環光遺傳學方法已經成功地用于通過抑制丘腦皮質神經元來停止皮質中的癲癇發作活動，并通過抑制局部錐體細胞，激發局部含小白蛋白的中間神經元或激活遠程小腦浦肯野細胞抑制癲癇發作[23]。

2.2 在帕金森病中的應用 帕金森（parkinson's disease，PD）是一種進行性神經退行性疾病，其特征是肌肉僵硬、運動緩慢和震顫。其發病機制是黑質致密部（SNc）中多巴胺能（DA）神經元的喪失，導致基底節（BG）中的神經元活動異常。主要是因為患者的神經系統活動發生變性，且隨著時間的推移，患者的癥狀會更加嚴重。此病一般多出現在老年人中，但近幾年越來越趨于年輕化[24]。

目前PD的治療方案主要包括左旋多巴（L-DOPA），多巴胺激動劑或MAO-B抑制劑的給藥或深部腦刺激（DBS）形式的手術或神經消融手術。但是這些治療是對癥治療，不能預防PD惡化，并且可能伴有明顯的不良反應，而且深部腦刺激（DBS）缺乏空間特異性，不能精確地定位到靶細胞中。因此，顯然有必要探索新的治療途徑[25]。光遺傳學的出現，能讓我們從神經元及神經回路的水平上更深一步地了解帕金森病的發病機制以及對其診斷和治療方面有新的認識。最近的一些研究顯示，光遺傳學刺激可以改善帕金森氏嚙齒動物的運動行為。研究表明，對丘腦下核（STN）或新皮質M1區域的第5層進行高頻光遺傳學刺激可改善經6-羥基多巴胺（6-OHDA）處理的小鼠的運動行為[26]。這表明光遺傳學刺激可以用作電DBS的更具選擇性的替代方法，從而刺激選擇性的STN群體，而不是電DBS的非特異性作用。有研究發現使用光遺傳學刺激NpHR可以對STN中的谷氨酸能細胞進行光遺傳學低頻抑制，既可以減少帕金森氏癥的行為，又可以減少6-OHDA處理的大鼠的L-DOPA誘導的運動障礙。研究報道[27]，在雙側6-OHDA損傷的D1-Cre和D2-CreBAC轉基因小鼠紋狀體中表達ChR2。通過光遺傳刺激直接和間接通路的中間棘狀投射神經元（MSN），觀察到直接通路激活后運動行為完全恢復到病變前的水平。光遺傳技術為帕金森的發病機制的研究及治療提供了可行的策略。

2.3 在阿爾茲海默病及術后認知功能障礙中的應用 阿爾茨海默病（alzheimer's disease，AD）是一種漸進的多因素神經退行性疾病。臨床上AD的病理特點是記憶、認知和運動功能嚴重缺陷，導致精神、行為和功能活動的下降，如失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變，病因迄今未明。目前臨床上使用抗AD藥物仍主要是膽堿酯酶抑制劑（如多奈哌齊、加蘭他敏、卡巴拉汀和石杉堿甲等）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（如美金剛），但是這些藥物療效有限且不良反應明顯，如胃腸道反應和神經系統反應等。光遺傳技術的優勢在于可以控制特定神經回路的活動。研究表明，光刺激雙側海馬齒狀回中表達CaMK-CHR2的神經元改善了測試階段的工作記憶和短期記憶[28]。最近研究報道了AD小鼠空間學習記憶缺陷的突觸機制[29]，內嗅皮質Ⅱ（ECII PN）錐體神經元的突觸末端直接支配CA1小清蛋白（PV）神經元（CA1 PV）并在早期AD小鼠中選擇性退化，ECII PN-CA1 PV突觸的缺失會破壞CA1回路中的興奮性和抑制性平衡，并損害空間學習和記憶。ECIIPN的光遺傳學激活通過θ脈沖刺激范式能誘導有益效果并有效防止AD小鼠的突觸和行為衰退。通過光遺傳技術為治療AD疾病進展提供了一個有希望的靶點。

2.4 在抑郁癥中的應用 抑郁癥又稱抑郁障礙，抑郁是一種情緒障礙，其特征是情緒低落或失去興趣或愉悅，其他癥狀包括體質量、食欲和睡眠情況的波動；無價值感；優柔寡斷或難以集中注意力；自殺意念。重度抑郁癥嚴重限制心理社會功能，降低生活質量。目前，抑郁的治療方法包括藥物療法、心理療法和幾種所謂的軀體干預方法，如電休克療法[30]、光療法[31]、迷走神經刺激[32]和經顱磁刺激[33]。

光遺傳學出現徹底改變了抑郁的神經回路機制的研究。光遺傳學已經闡述了抑郁的特定細胞類型和投射途徑，推動對抑郁的基于神經回路研究的轉變。光遺傳學工具成為了研究動物模型中抑郁樣行為背后的神經回路的關鍵，借助光遺傳學闡明了腹側被蓋區、伏隔核、內側前額葉皮質、腹側海馬和其他邊緣區域對壓力易感性發揮了關鍵作用[34]。使用光遺傳學技術，已經發現壓力環境和腹側海馬-伏隔核回路的階段性激活是誘導社交回避的必要條件。研究表明[35]，在慢性社交失敗壓力的抑郁癥小鼠模型中，使用光遺傳學操作雙向控制傳入特定的突觸功能，證明了腹側海馬中谷氨酸能信號傳導在抑郁相關行為中的復雜傳入特異性作用。慢性壓力可能會將平衡從內側前額葉皮質轉移到腹側海馬控制，從而形成一個強化循環，進一步增強腹側海馬-伏隔核的突觸傳遞。最近研究報道[36]，對腹側被蓋區-伏隔核回路的選擇性光遺傳學激活增加了D1-多棘神經元中Shisa6的表達。Shisa6特異性位于D1-多棘神經元的興奮性突觸中并增加神經元的興奮性，從而促進小鼠的抑郁樣行為。同樣，也可以通過使用光遺傳學技術改變特定細胞類型中的神經元活動來改變抑郁樣行為。有研究報道[37]，內側前額葉皮質神經元的光遺傳激活逆轉了動物失敗社交和蔗糖偏好，這表明誘導內側前額葉皮質神經元的過度活躍可能足以抑制一些與抑郁癥相關的行為。綜上可見，光遺傳學在治療抑郁癥方面具有廣闊前景。

2.5 在亨廷頓舞蹈癥中的應用 亨廷頓舞蹈癥（huntington' disease，HD）是一種罕見的常染色體顯性遺傳性神經退行性疾病，癥狀復雜多變，以慢性進行性舞蹈樣動作、認知功能障礙和精神行為異常為主要臨床特征，是由亨廷頓基因（HTT）中的CAG三核苷酸重復擴增引起的，該基因編碼亨廷頓蛋白（HTT）中擴增的聚谷氨酰胺[38]。細胞和分子研究表明，腦發育異常可能是HD腦功能受損和后來神經變性的底物。先前研究表明，突變的HTT（MHTT）相關的神經發生發育損傷可能有助于區域和細胞對晚期選擇性神經變性的脆弱性。試驗者采用光發生學和電生理學方法，從小鼠離體大腦切片上研究了紋狀體突觸傳遞。結果發現HD小鼠模型中，紋狀體突觸傳遞與突觸前膜GABA釋放的數量增加并無明顯關聯，而是與GABA釋放后的突觸部位反應增強有關，快速激活或抑制可為急性糾正神經元的異常活動提供治療干預方法。利用光遺傳學技術抑制紋狀體GABA神經元活動，可見內皮細胞對堿性成纖維細胞生長因子的表達增加，并減少腦萎縮量，促使神經細胞活動趨于正常，HD相關的異常活動恢復正常。因此光遺傳學為治療亨廷頓舞蹈癥提供了新思路。

3 小 結

盡管光遺傳學具有巨大潛力，但光遺傳學仍存在局限性和挑戰性，必須加以考慮和解決。在大腦內部，光的傳輸通常是通過手術將光纖插入特定區域來實現的。侵入性手術不可避免地會導致腦部損傷和不良反應的產生，如感染和出血等。一項研究成功地證明，上轉換納米粒子（UCNP）可以吸收大腦外部發射的近紅外光，從而將其轉換為可見光的局部發射并刺激大腦的深層結構。UCNP技術將使得微創光學神經元活動的操縱具有遠程治療的潛力。Chen[39]最近的研究表明使用強效的視紫紅質ChRmine來實現經定義的神經回路（包括中腦和腦干結構）的經顱光刺激，在前所未有的深度達到7 mm時達到毫秒級。并且使用ChRmine的全身性病毒傳遞，可以無須手術即可演示行為調節，從而實現無植入物的腦深部的光遺傳學。

目前，光遺傳學技術現在中樞神經系統疾病治療上面臨的主要障礙是從臨床前研究到臨床應用的轉變，從疾病模型到臨床患者的轉變。目前主要面臨以下幾個問題：①光遺傳學中使用的視蛋白是外源蛋白，而外源蛋白在大腦中的長期表達引起了人們對免疫原性的關注。②盡管病毒載體如AAV是一種依賴病毒，意味著僅靠它無法產生感染。但病毒載體仍具有抗原性，會使機體產生免疫反應。③光刺激方式在中樞神經疾病患者治療上的選擇。光遺傳學未來繼續發展的主要方向可以集中在：視蛋白變體的發現和對已知視蛋白的改造，爭取可以使較低強度或較長波長的光以進入更深的組織區域。探索更具有細胞靶向性的載體，使得視蛋白能夠更準確地在特定神經元上表達。探索類似于上轉換納米顆粒的光遺傳學工具，以滿足深層的組織穿透深度和低的光熱效應。中樞神經系統治療中光遺傳閉環系統的敏感性與穩定性。盡管光遺傳學在臨床上應用仍有許多挑戰，但對于它的前景仍然充滿憧憬。