腦缺血性卒中血腦屏障破壞模型建立與功能障礙的定量檢測方法及進展

楊凈松呂 梁宋 巍劉興利

(云南省第一人民醫院放射科,昆明 650000)

腦卒中(stroke)尤其是占大部分的腦缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是當前威脅人類的尤其是發展中國家人民健康的首要因素[1-2],IS 主要是由突然流向大腦的局部腦血流量減少引起的,腦血性卒中后不久,代謝紊亂和能量失衡在細胞和亞細胞水平傳播到繼發性損傷機制中如炎癥、神經膠質細胞增生和氧化應激等,繼而導致神經元,神經膠質細胞和血管內皮細胞死亡。

血腦屏障(BBB)是中樞神經系統的獨特而重要的特異性結構,早期認為BBB 可以調控腦組織血流供應,在控制物質交換功能上也具有重要的調節的作用[3],參與維持腦組織液中水和電解質的平衡,并且必須保護神經元免受血液中潛在有害物質的侵害[4],BBB 損傷和功能障礙是腦缺血后卒中的突出病理特征,缺血卒中后的腦細胞水腫、凋亡到壞死過程BBB 的破壞程度與發病的嚴重程度有著密切的關聯,但既往的實驗僅僅關注BBB 的破壞與否,既0 或1,對于BBB 破壞程度的量化仍是實驗中的一項難題,本文將針對各種動物模型及相關BBB影像學評估手段的最近進展進行闡述及回顧。

1 與BBB 構成結構破壞的相關檢測敏感標記物

BBB 內側為血管內皮細胞以及其周圍的緊密連接(tight junction,TJ)構成的,參與構成TJ 主要結構蛋白包括ZO-1、occludin 與claudin-5 等,在腦缺血卒中發生后可以通過免疫組化與蛋白質印跡實驗評估連接蛋白的表達,繼而反映血腦屏障的破壞情況(BBB 破壞時連接蛋白表達、分布減低)[5],實驗證實,缺血2 h 后,BBB 在體外和體內均受到破壞,在體外細胞實驗中, BBB 的破壞主要由caveolin1 介導的claudin-5 重新分布和MMP 介導的閉合蛋白降解導致快速內皮屏障破壞引起的氧葡萄糖剝奪[6],因此ZO-1、occludin 與claudin-5 的表達改變提示了血腦屏障破壞與重建,BBB 內皮細胞較周圍毛細血管內皮細胞較為明顯的特點是豐富的線粒體量,有實驗發現在梗塞后30 min,約60%受缺血影響的血管顯示出了內皮水腫,并伴有水腫星形細胞,證實在缺血性腦卒中發生后血管內皮水腫早于BBB 破壞[7],同時也暗示BBB 的破壞是一系列級聯反應引起的,是一個動態變化的過程。

周細胞除了血腦屏障(BBB)的發育和維持,跨BBB 的白細胞運輸和血管生成外,調節神經組織血流以配給相應的神經代謝也起到了重要作用[8]。周細胞對于缺血較敏感且容易受損而產生大量的過氧化酶如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧化酶4(NOX4)等[9-10],這種酶會在梗塞周圍區域的微血管周細胞中表達上調,這有助于激活金屬蛋白酶9(MMP-9)加劇BBB 分解[11],發生IS 后,血漿基質金屬蛋白酶(MMP)首先升高,MMP 是一種蛋白水解酶,可以降解細胞外的大多數成分并重塑細胞外空間,其中如MMP-9 異常升高與腦卒中的加劇存在關聯[12],實驗證實血腦屏障的破壞與MMP-9表達增加呈明顯相關[13],這些機制會加重缺血卒中后的組織損傷和腦水腫[14],因此,預防周細胞功能障礙可通過促進微循環再灌注并預防出血和水腫來改善再通療法的療效。 在梗塞周圍組織中,周細胞與微血管分離并促進血管生成和神經發生,對中風預后產生積極影響,有研究證實血小板衍生生長因子-β(PDGFR-β)在周細胞中表達上調[15-16],其數量增加并開始從微血管壁遷移至新形成的脈管芽以促進缺血性損傷后的成熟。

2 腦缺血卒中BBB 破壞的模型建立與BBB 破壞的實驗檢測方法進展

2.1 體外BBB 細胞培養模型及與其局限性

體外BBB 模型的構建主要是基于原代細胞或永久腦內皮細胞系(BCE)的細胞培養模型,目前主要應用于研究BBB 的滲透性篩查、各種藥物向腦內轉運的模式檢驗與腦血管毛細血管內皮細胞物質轉運機制及病理生理研究[17]。 與基于動物的IS 體內模型相比,體外模型具有多種優勢:(1)研究缺氧/葡萄糖糖減低對細胞死亡的影響更為直接和容易;(2)可以在血腦屏障內的細胞水平上進行代謝研究,而不會使其他器官的其他細胞復雜化;(3)可以容易地研究培養細胞之間復雜的細胞內信號傳導途徑及其在疾病過程中的潛在作用[18]。

不同物種的BBB 體外模型構建采用以進行各方面的研究工作,其中小鼠或大鼠來源的腦內皮細胞培養物的優勢在于其來源已充足,并且經常被用作臨床前研究的首選[18],在腦缺血性卒中的BBB研究主要聚焦于氧氣葡萄糖剝奪(OGD)條件下腦血管內皮細胞的病理改變與各種蛋白、水解酶、核酸等物質的表達檢測及BBB 其他細胞如周細胞在缺血缺氧狀態下的功能改變與保護/破壞作用機制研究[19-22],盡管大/小鼠的腦容易獲得,但這些物種中內皮細胞的普遍產量較低,實驗的可重復性也受到各種因素影響。 其他動物如牛、豬等動物細胞的體外模型也應用于BBB 的相關研究當中,但是鑒于不可避免的物種差異,一種可靠的人源性體外BBB模型將對高通量篩選以識別腦穿透分子或研究BBB 的發育,調節和疾病途徑顯然具有更高的實驗價值。

采用完全分化的表型的人腦內皮細胞的原代培養對于藥物開發和臨床前研究是一種理想的建模工具[23],但新鮮的人腦組織很難保證持續的獲取。 人類干細胞模型目前正在完善[24],有學者通過模擬類似于胚胎腦體外的微環境使得人多功能干細胞(hPSC)成功向腦內皮細胞分化[25],所得的內皮細胞具有許多BBB 屬性,包括組織良好的緊密連接,營養轉運蛋白的適當表達和極化的外轉運蛋白活性,成功檢測到葡萄糖轉運蛋白GLUT-1、連接蛋白occludin-5、claudin-5 以及p-糖蛋白在內皮細胞中共表達[26],如果證明這種體外建模方法易于處理并具有良好的可重復性,將為該領域的研究人員提供巨大的機會。

雖然體外的細胞培養技術逐漸進步,體外的BBB 結構及功能也越來越接近實驗動物(人)體內,但BBB 是一個復雜的結構,其病理生理改變有多重復雜的細胞間相互作用,且研究過程中關注的僅僅是與BBB 功能有緊密關系的相關蛋白,并沒有將體外的BBB 結構作為一個有機動態的整體進行研究。新鮮的原代細胞獲取一直是限制體外BBB 研究的瓶頸,已經有將星形細胞及周細胞與內皮細胞共同培養以模擬體內環境以提高內皮細胞相關功能高表達的方法[27],但始終無法達到內環境的復雜調節,有學者通過評估永生化的hCMEC/D3 和原代hpBEC 細胞系的總體基因表達譜,發現腦微血管內皮細胞(BEC)中重要的功能相關基因的表達出現了明顯的減低[28],證明BEC 中高表達并被描述轉錄BBB 功能的特異性蛋白的相關基因表達受到分離培養細胞的影響,這可能與天然內環境的剝奪密切相關,故體外研究在相關的病理生理研究中仍然有較明顯的局限性。

2.2 腦缺血卒中動物模型建立與BBB 的破壞檢測

多種動物(小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、豬、靈長動物)等用于腦卒中后BBB 功能觀察及腦缺血在再灌注的神經病理生理及顯微解剖相關的研究。 在各類文獻中,占大多數的是鼠(約80%),這是因為鼠(小鼠/大鼠)的缺血性腦卒中模型的建立具有簡單方便、具有較高的可重復性與成功率。 目前使用的缺血性腦卒中建模方法最常用的是MCAO(線栓法大腦中動脈局灶性腦缺血模型),閉塞時間一般為60～120 min 不等,具體實驗步驟不再贅述[29-30],需要注意的是在MCAO 處理后可能由于丘腦受損而導致體溫過低,故需要一定的保溫措施,使其體溫保持在約37℃。

目前對于腦卒中動物模型與BBB 功能的相關研究主要集中在BBB 在IS 后的動態變化,既BBB在IS 后的各個時間段的顯微結構、功能與相關蛋白表達的變化研究,與之相關的各種神經保護藥物的應用及藥物對BBB 的功能保護機制研究等方面。對于BBB 的功能失調的定量研究主要包括染色劑的定量檢測既伊文斯藍(EB)的定量檢測與異硫氰酸熒光素-右旋糖酐(FITC-Dextrans)免疫熒光檢測,下面主要針對兩種檢測方法進行探討。

2.3 伊文思藍(EB)進行BBB 滲漏定量檢測

EB 染料具有很強的結合血清白蛋白的能力,可作為示蹤劑檢測血管滲漏并定量BBB 分解,EB的定量檢測是一種公認且敏感的技術,已被用于評估包括缺血性中風在內的神經疾病中的血腦屏障完整性和功能[31-33]。 該方法經濟簡便、高效,具有較高的可重復性,并且可以適用于任何實驗室,目前廣泛應用于各種相關BBB 的功能紊亂研究中[34]。 具體方法為:在MCAO 建模成功后,采用靜脈注射法(鼠尾靜脈/頸靜脈/股靜脈)緩慢注射EB 染色劑(5 min 注射完成),按照期望的時間(缺血后指定時間或再灌注指定時間等)處死,取出大腦,解剖大腦半球,銳器分離左右半球并分別稱重,在磷酸鹽緩沖鹽水中制勻漿,然后使用渦旋儀將其與2.5 mL 三氯乙酸(60%)混合之后進行離心15 ～30 min,隨后靜置于并低溫保存約10 min,吸取上清液,使用分光光度計在610 nm 處估計EB吸收[33,35],根據EB 的標準曲線估計EB 滲漏的量,并將結果表示為ug/g。

EB 染色劑的定量評估主要用于以下方面:(1)BBB 相關研究如各種疾病模型的BBB 功能變化,使用EB 染色劑滲漏量衡量BBB 的破壞程度,結合金屬激酶MMP 等BBB 破壞相關聯的水解酶[36],繼而分析BBB 破壞程度的動態變化及與相關疾病病程變化的相關性[37-38],通過BBB 結構蛋白(ZO-1、occludin-5、claudin-5)等相關功能蛋白的表達檢測以了解BBB 破壞的機制[36];(2)在藥物研究中用于評估某種藥物(刺激因素)對疾病模型的治療/緩解效果[38-41],將染色劑的定量分析作為評估BBB 破壞情況的客觀指標,繼而了解實驗/對照組在進行干預后的BBB 功能差異,并對藥物效果進行評估;(3)用于驗證BBB 誘導破壞模型建模是否成功[42]。

雖然EB 定量檢測法簡單易行,但是EB 染色在檢測過程中需要進行血管內的沖洗灌注然后再進行腦實質內的染料提取,這一過程中可能造成腦內小血管再破裂導致腦實質內染色劑增多[43-45],且操作的人員個體及技術差異可能導致結果的差異,對于定量檢測來說其客觀性會受到質疑。 分光光度計測量的EB 染料濃度,在大體上無法進行EB 染色區域的定量(BBB 破壞范圍),Reeson 等[46]在研究抑制VEGF 信號轉導對腦卒中的保護作用中應用免疫熒光圖像定量分析的方法,將梗死區域內熒光體積減去血管官腔內熒光面積,之后將周圍皮層的染料熒光面積減小鼠相對應深度的對側染料熒光以量化EB 的滲漏,在將來的研究當中值得進一步應用。

2.4 異硫氰酸熒光素-標記物熒光(FITC-)進行定量檢測

使用異硫氰酸熒光素(FITC)標記不同分子量的物質(白蛋白、高/低分子量右旋糖酐、葡萄糖等),尤其是FITC-Dextrans 是用于檢測BBB 滲漏常用試劑[44,47-49],該物質具有不同的分子量,一般為了使BBB 滲漏實驗效果明顯,常選用分子量相對小的試劑用以標記BBB 滲漏的感興趣區[50-51],高分子量(2000×103)的FITC-Dextrans 可以很好地吸附于血管壁內,繼而作為標記血管管腔的高亮熒光標志而被識別,且在BBB 出現明顯破壞滲漏時,大分子FITC-Dextrans 也可以在管腔外被識別,故也可以用于BBB 滲漏的定量研究中,Chen 等[52]在使用大鼠進行腦缺血卒中BBB 破壞對周圍腦組織研究中通過半自動測量FITC-Dextrans 標記的熒光總面積,再根據高亮區域(既血管管腔內的FITC-Dextrans 富集)調整亮度閾值,計算血管面積,繼而計算出滲漏的熒光面積值,證明了BBB 破壞程度(高分子FITCDextrans 周圍滲漏面積)與腦組織損傷的體積密切相關;Michalski 等[47]利用高分辨率掃描儀結合圖像后處理工具對FITC-白蛋白(70×103)的連續切片進行熒光面積計算,并逐層累計(×層厚)最后得出BBB 滲漏組織的體積;Jin 等[53]將大鼠前囟作為基點作冠狀切片,將前囟至后方2 mm 的切片作為觀察切片,使用圖像處理軟件進行多層面熒光定量檢測(顯微鏡下FITC-Dextrans 亮度最高、面積最大)熒光面積總和,并得到平均滲漏面積作為定量指標繼而驗證不同分子大小的FITC-Dextrans 在大鼠IS 不同時間點的滲漏,繼而反映BBB 在IS 后的動態變化與相關機制;Bankstahl 等[51]在其進行大鼠癲癇發病后BBB 功能變化研究時應用半定量分析法(每只動物分析了4 個冠狀腦切片,根據FITC-白蛋白的細胞外分布進行評分,無=0 分,靠近血管的極小的細胞外分布=1 分;局灶性的細胞外聚集=2 分;大量的彌散分布的聚集=3 分,計算平均值)進行BBB 滲漏情況的評價以了解BBB 在癲癇發作后的動態改變;上述實驗由于重復性及樣本量等因素影響,目前尚未形成一種公認的、標準的定量評估方法。

Xu 等[48]利用EB 的熒光染色與大分子量(2000×103)FITC-Dextrans 免疫熒光染色特性,由于大分子FITC-Dextrans 會聚集在血管管腔內,故可以利用這一特性計算FITC-Dextrans 覆蓋面積以估算血管面積,使用顯微圖像處理軟件對切片進行分析并得到EB 熒光染色的集合光密度(integrated optical density,IOD)與FITC-dextrans 滲漏面積,計算兩者的比值(IOD/AreaFITC-Dextran),這種做法可以降低血管熒光對于BBB 滲漏量化的影響,但是這種方法目前僅應用于誘導的BBB 滲漏,并未用于IS 引起的BBB 滲漏中,根據既往研究,當IS 發生后發生BBB 滲漏嚴重程度更重,故血管內外均可見FITCDextrans 分布,如果可以結合Chen 等[52]的研究策略,分析EB 熒光的IOD 值與FITC-Dextrans 熒光的面積滲漏面積(總面積-血管面積)的關系以發現更好的BBB 滲漏評估手段,值得進一步探討。

3 影像學方法對于血腦屏障破壞的相關檢測技術進展

在正常生理條件下,CT 增強檢查中所應用到的對比劑如碘對比劑與MRI 增強所用到的對比劑如釓類對比劑均為大分子物質,無法通過功能正常的BBB 進入腦組織質微環境內,故在正常增強造影時腦實質不會強化,如果BBB 功能發生破壞,則會發生對比劑通過BBB 進入腦實質,使得腦實質異常強化,故對于BBB 的破壞評估實際上是對原本不能通過BBB 的物質(對比劑)進行量化以反映BBB 破壞程度。

已經有研究通過檢測腦實質中大分子對比劑量來反映相關疾病如腦退行性疾病等對于血腦屏障功能的影響,如應用Patlak 模型的CT 灌注成像中的滲透系數-滲透性-表面積乘積(permeabilitysurface area product, PS)[54],使用這種參數來反映腫瘤、腦缺血卒中等病變對于BBB 破壞的檢測,也有應用這種模型進行動態增強技核磁共振(dynamic contrast enhanced MRI, DCE-MRI),產生類似的參數如容積轉移常數Ktrans(transfer constant),目前這種技術主要在中樞神經系統疾病主要應用,進行腦內小血管滲透性定量評估和腦小血管疾病器質性評價[55],但是以上技術方法都是基于數學模型的模擬計算,對于腦組織內真實的對比劑滲漏情況無法切實反映。

目前已經有對于腦實質內對比劑定量分析的技術,主要為CT 雙能量碘分析技術與磁共振檢查的高強度急性再灌注標記物(HARM)檢測技術。 對于碘對比劑,雙源雙能量CT 于圖像重建后在圖像空間域使用三物質解析算法,應用碘圖可對特定區域組織內的碘含量進行定量,目前雙能量掃描可以將水平在0.3 ～0.5 mg/mL 的極低量碘進行精確的定量評估[56]; 高強度急性再灌注標記物(hyperintense acute reperfusion marker,HARM),被定義為急性卒中患者對比后FLAIR 圖像上蛛網膜下腔或蛛網膜下腔的延遲增強,并被認為與BBB 的通透性變化有關,已經有文獻對于腦梗死后對比劑的外滲與出血的HARM 改變與CT 進行對照及腦短暫性缺血后的在今后的研究領域中[57-58],HARM 與雙能量CT 在對比劑外滲的相關性與腦缺血卒中的研究潛力。

4 總結與展望

綜前文所述,對于腦缺血性卒中后BBB 的相關研究目前主要在腦缺血后的BBB 功能變化與相關機制,各種干預因素(藥物)在腦缺血后對BBB 功能的保護機制與療效評估,根據新近文獻對卒中后后BBB 破壞的探討,隨著無創檢查技術的進步(MRI、CT 功能成像),雖然相關技術已經有報道,但目前尚無相關實驗發現明確的與BBB 實驗定量相關性或衡量手段,如果可以在無創檢查與活體BBB 破壞之間尋找到相關的實驗數據可以支撐其高相關性,使得BBB 的破壞檢測可以通過影像學檢測發現,繼而應用于高級動物模型中,在今后的BBB 相關實驗中將是飛躍性的進展。