發作性睡病動物模型研究進展

王笑冉鄭 攀

(河南中醫藥大學基礎醫學院,鄭州 450046)

發作性睡病一詞,由Gelineau 于1880 年首次提出,本病是一種原因不明的中樞性睡眠障礙,以白天不可抗拒的短期嗜睡發作和異常的快速動眼睡眠(猝倒、睡眠幻覺和睡眠癱瘓)為典型特征,多于兒童或青年期起病[1]。 由于對此病缺乏認識,常出現漏診而延誤治療,嚴重影響患者的工作學習生活,甚至造成意外事故危及生命。 選擇合適的動物模型用于研究該病發病機制,發掘潛在的治療靶點顯得尤為重要。 本文對目前已有的發作性睡病模型進行綜述,總結其誘發機制、模型應用的優缺點等,以便研究者可以據此選擇更貼合實驗目的的造模方法,獲得更準確的研究結果。

1 自發性動物模型

自發性動物模型指實驗動物未經任何人工干預,在自然狀態下發生的、或由基因突變的異常表現通過遺傳育種保留下來的動物疾病模型[2]。 目前,已證實的NRL 自發性模型為犬類動物模型。 早在上世紀八十年代,人們在犬身上發現與人類發作性睡病極為相似的癥狀[3-4]。 1999 年,Lin 等[5]揭示了犬發作性睡病是由于食欲素受體2(orexin receptor 2, OX2R)的基因突變。 家族性發作性睡病呈常染色體隱性遺傳存在于杜賓犬和拉布拉多獵犬的品系中,由OX2R 基因的外顯子跳躍突變引起,而散發性犬發作性睡病與腦脊液中食欲素多肽顯著降低有關。 其表現為突然的肌張力喪失和快速動眼睡眠(rapid eye movement sleep, REM)發作,首次出現在青春期前,成年后癥狀相對減輕[6-7]。 自此各種基于下丘腦泌素/食欲素系統(hypocretin,Hcrt)的動物模型根據不同的研究目的被建立。

2 基因工程模型

2.1 基因敲除模型

2.1.1 Hcrt/Orexin 基因敲除小鼠

食欲素(orexin),又稱下丘腦泌素,是下丘腦外側區食欲素能神經元合成和分泌的小分子神經多肽(Hcrt-1、Hcrt-2 或稱Orexin-A、Orexin-B),其來源于同一種前體多肽并通過蛋白水解產生[8-9]。 人類食欲素原基因(prepro-orexin)由兩個外顯子和一個內含子組成,通過克隆prepro-orexin-nlacZ融合基因替換小鼠prepro-orexin基因的第一個外顯子獲得重組基因并導入C57BL/6J 小鼠胚胎干細胞,借助雜交建立純合子Orexin 基因敲除小鼠。 經免疫組化、原位雜交及放射免疫分析方法均證實,該小鼠Hcrt神經陽性表達喪失,出現與人類NRL 相似的嗜睡、睡眠周期縮短及次數增加等癥狀。 表現為REM 潛伏期縮短,覺醒時間略有減少,覺醒-REM 轉換加快,但有正常的非快速動眼睡眠(non-rapid eye movements, NREM )[10-11]。 Mochizuki 等[12]對Orexin 基因敲除小鼠進行深入研究,證實其具有正常睡眠-覺醒行為的晝夜節律控制,且受Orexin 高度刺激的促覺醒單胺類神經遞質如去甲腎上腺素和組胺等未見異常。 Orexin 基因敲除小鼠證明了Hcrt 神經元是內源性睡眠/覺醒調節系統的重要組成部分,但代償表達增強的下丘腦外側黑色素濃縮激素神經元仍可調節睡眠-覺醒回路,明顯干擾了研究對Orexin 基因本身表達產生嗜睡的解釋[13-15]。2.1.2 OX2R/OX1R 基因敲除小鼠

Orexin 通過與G 蛋白偶聯受體(OX1R 和OX2R)結合,參與調節多種生理反應。 在大腦皮層,OX1R 和OX2R 的mRNA 表達有明顯的晝夜節律[16-17]。 Willie 等[18]通過線性化載體的同源重組,在胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)中用β 半乳糖苷酶(LacZ)和新霉素抗性(NEO)表達盒替換OX2R 基因第一個外顯子。 正確定向的ES 細胞克隆被分離并注射到C57BL/6J 囊胚中。 純合型小鼠無法檢測OX2R mRNA 表達,在睡眠結構上表現出輕度的REM 睡眠增加和猝倒發作,并出現清醒狀態下的NREM 睡眠侵入。 Kalogiannis 等[19]基于純合單受體基因敲除雜合子OX2R/OX1R 構建雙重Orexin 受體基因敲除小鼠,表現出了較OX2R 基因敲除小鼠更強烈的發作性睡病表型,特征為頻繁發作的覺醒-睡眠轉換;REM 睡眠潛伏期縮短,時間延長;覺醒時間顯著減少并出現猝倒發作,其與Orexin基因敲除小鼠行為學相似。 對Hcrt 受體的遺傳操作是構建發作性睡病模型的另一種方法。

2.2 轉基因模型

2.2.1 Orexin/Ataxin-3 轉基因小鼠

Ataxin-3 是脊髓小腦性共濟失調3 型的疾病蛋白,多選用SD 大鼠或Wistar 小鼠建模。 Beuckmann研究小組首次構建Orexin/Ataxin-3 mice,通過在prepro-orexin啟動子后連接一段在N 端表達含有多聚谷氨酸片斷的ataxin-3 蛋白,在C 端連接用于組織學檢查的Myc癌基因序列,對尾部活檢組織的基因組DNA 進行PCR 擴增并注射到Wistar 小鼠受精卵原核中,產成Orexin/Ataxin-3 轉基因系[20-21]。 由于Hcrt 啟動子驅動的細胞毒基因產物PolyQ-ataxin-33 積累,Hcrt 神經元逐漸選擇性地丟失。 17 周齡,用Myc 標記免疫組織化學染色法檢測顯示轉基因小鼠下丘腦外側區出現Hcrt 陽性神經元喪失,在乳頭核、中央灰質、穹隆周圍核、弓狀核等同樣缺乏Hcrt 投射。 在睡眠結構上,模型小鼠表現出亮期REM 潛伏期縮短,暗期覺醒時間減少、REM 睡眠時間延長,覺醒-REM 轉換加快,但在24 h 的清醒和NREM 睡眠時間保持不變。 此模型中Hcrt 神經元消融是漸進性的,減輕了結構性食欲素原基因敲除的代償作用,更能代表人類發作性睡病的病理改變。2.2.2 OX2R 轉錄干擾小鼠

OX2R 對Orexin-A 和Orexin-B 表現出同等的親和力,在大腦皮層、隔核、海馬、丘腦內側核、中縫核和許多下丘腦核(包括組胺能結節乳頭核)中的表達顯著[22-23]。 基于Cre-loxP 重組[24],采用了轉錄干擾策略在EL250 細菌細胞中構建靶向載體,使用loxP 側翼的基因盒來干擾OX2R 的產生,利用下丘腦結節乳頭核(tuberomammillary nucleus, TMN)神經元orexin-A 細胞電生理反應的缺失驗證該菌株中OX2R 信號的缺失。 進一步將編碼Cre 重組酶的腺相關病毒載體(AAV-Cre)注射到C57BL/6J 小鼠雙側顳下頜核區,以確定局部恢復OX2R 表達;并通過OX2R 轉錄干擾小鼠與雌性胚系中表達Cre 重組酶的Zp3-Cre 小鼠(jackson laboratory)雜交,完全恢復OX2R 信號[25]。 模型小鼠維持清醒的能力降低,表現為嗜睡和睡眠碎片化;與Orexin 敲除小鼠不同,OX2R 轉錄干擾小鼠只有罕見的猝倒發作。 用AAV-Cre 局部恢復TMN 神經元和鄰近下丘腦后部的OX2R 后嗜睡癥狀有所減輕,但仍存在睡眠破碎。該模型制備過程是可逆的,可作為自身觀察對照,為NRL 的靶向治療提供思路,且為開發食欲素受體拮抗劑用于失眠的治療提供了科學依據。

2.2.3 O/E3 轉錄因子缺失小鼠

O/E3 屬于堿性螺旋-環狀轉錄因子家族,通過控制必需的下丘腦神經遞質的表達及下丘腦神經纖維的正常發育,在功能性Hcrt 能回路的建立過程中起著核心作用[26]。 研究發現O/E3 在NRL 和Hcrt 能群體退化的模型中表達下調[27]。 De La Herrán-Arita 等[28]使用pRVKI 載體來構建O/E3 靶向構建體,并用可選擇標記PGK-neo 取代O/E3 基因的前5 個外顯子。 克隆一個3.2 kb 的O/E3 啟動子區域的Xho IBamH I 片段,作為單純皰疹病毒酪氨酸激酶與pRVKI 的PGK-neo 選擇標記之間的5’同源臂。 從O/E3 基因下游至第5 外顯子的5.3 kb的Spe I-Sal I 片段被克隆為pRVKI 載體pGK-neo 選擇標記下游的3’同源臂。 再將PCR 和Southern 雜交檢測呈陽性,并攜帶正確的靶向插入的ES 細胞注射到C57BL/6NCr1 小鼠囊胚中,獲得O/E3 缺失的純合子小鼠。 其表現出REM、NREM 睡眠時間延長,REM 潛伏期縮短,暗期覺醒時間減少,出現睡眠幻覺及厭食癥狀。 免疫組化染色發現,O/E3 缺失導致下丘腦Hcrt 細胞數量顯著減少,局限于后部及穹隆周圍區域。 腦橋食欲素能神經支配受損,通過靜脈注射Hcrt-1 可逆轉發作性睡病表型[29]。 此模型突出了轉錄因子在控制睡眠-覺醒周期的神經亞群調節中的重要性,為理解復雜的食欲素神經元電路開辟了新的選擇。

3 化學誘導動物模型

3.1 白喉毒素A(diphtheria toxin chain A, DTA)誘導模型

白喉毒素是一種具有高度免疫原性的蛋白質,可導致生物神經脫髓鞘。 基于Tet-off 調控系統控制轉基因表達的技術,將白喉毒素受體基因特定表達于小鼠Hcrt 啟動子上,構建Teto DTA 小鼠。 用哺乳動物四環素控制的轉錄激活因子(tetracyclinecontrolled transactivator, TTA)片段取代Hcrt/nLacZ轉基因構建體的nLacZ基因,并注射到Teto DTA 小鼠受精卵(C57BL/6 小鼠)的原核中,通過C57BL/6J 小鼠培育出穩定的Hcrt-TTA 轉基因品系[30]。Hcrt 神經元變性由四環素反式激活因子Tet-off(Teto) 系統控制的,膳食多西環素(doxcycline,DOX)與TTA 結合,通過Tet-off 調節蛋白阻止DTA的合成。 由于TTA 被連接到Hcrt 啟動子上,從飲食中去除DOX 會啟動DTA 的合成,僅在Hcrt 神經元中產生神經毒性[31-32]。 配對的Hcrt-TTA 小鼠和Teto DTA 小鼠進行交配產生Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠,將10% DOX 粉添加入正常飼料,在產前和出生后12 周內使用含DOX 飼料喂養,后換成普通飼料喂養至14 周,再重復用DOX 飼料喂養至25 周。 在睡眠結構上,在去除DOX 飲食后14 d,Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠出現頻繁猝倒發作,主要發生在暗期及亮期的覺醒前期;REM 潛伏期縮短、睡眠時間延長;睡眠-覺醒轉換次數增加。 行為學上,表現為進食量無改變,但運動減少,體重增加。 DAT 誘導模型可通過比較同一個體動物在Hcrt 神經元消融之前、期間和之后的行為和生理學,來研究Hcrt 神經元消融過程中NRL 的癥狀進展;且Hcrt 神經退行性病變在青春期前后誘導,更符合人類NRL 的發病進程。 模型小鼠體重增加,但食物攝入未改變,這與人類NRL 代謝表現類似。 實驗者可自行控制Hcrt 神經元消融時間和持續時間,可用于猝倒的藥理學研究,在Hcrt 神經輸入受限時的網絡重組研究。

3.2 核糖體失活蛋白(saporin, SAP)誘導模型

將內源性配體Hcrt2 與SAP 偶聯,構建Hcrt2-sAP 神經毒素。 研究證實Hcrt2-sAP 可與含有HcrtR2 受體特異性結合,向大鼠下丘腦外側核注射Hcrt2-sAP 可破壞Hcrt 神經元,從而減少腦脊液中Hcrt 含量,誘導大鼠的發作性睡病行為[33]。 Blanco-Centurion 等[34]利用Hcrt2-sAP,將其分別注入大鼠下丘腦外側和腹側0.5 mm 處,當Hcrt2-sAP 應用于下丘腦外側時,受損大鼠出現NRL 表型;而損傷內側隔區Hcrt 受體神經元并未觀察到NRL 癥狀。 嗜睡大鼠表現出REM/NREM 睡眠時間延長;肌張力增加且出現廣泛的肢體運動。 Arias-Carrión 等[35]對此模型大鼠進一步研究發現,當73% Hcrt 受體神經元被成功損毀時,腦脊液中Hcrt 水平降低50%。 并利用睡眠剝奪法檢測下丘腦增食欲素表達,來測試睡眠調節的動態平衡機制,結果顯示在損傷后6 h,增食欲素水平未見增加。 Hcrt2-sAP 誘導模型可通過靶向損傷受體神經元,闡明特定的Hcrt 神經支配在睡眠-覺醒行為中的作用,為探索移植作為NRL的治療手段提供了思路。 但由于Hcrt2-sAP 可消融其他表達食欲素受體的LH 細胞群體,包括黑色素濃縮激素神經元和含腺苷脫氨酶的神經元等[36-37],所以此類模型與人類NRL 的發病機制存在差異。

3.3 硝基還原酶-甲硝唑誘導的斑馬魚模型

Hcrt 能神經元在斑馬魚中表現出調節睡眠和清醒行為的雙重功能[38]。 Elbaz 等[39]將大腸桿菌的硝基還原酶B(nitroreductase B, nfsB)轉基因特異性表達于Hcrt 能神經元中,構建了時空可控的Hcrt能神經元消融的轉基因斑馬魚模型。 硝基還原酶通過將無害的前體藥物甲硝唑(metronidazole,MET)轉變為具有毒性的產物,對Hcrt 神經元進行消融[40-41]。 模型表現出白天REM 睡眠時間延長,睡眠-覺醒轉換次數增加,對外部刺激反應性降低。由于斑馬魚Hcrt 神經元網絡只由20 ～60 個腦神經元組成,因此造模簡單,易于操作[42],但與人類在解剖結構、生理反應上均存在較大差異。

4 光遺傳學模型

Williams 等[43]在食欲素原啟動子下游插入修飾的Arch-3 gene,用1.5 kb 的Arch 片段替換Hcrt/nLacZ 構建體的LacZ基因,將其表達為與增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluoresce protein,EGFP)的融合蛋白,從而獲得轉基因載體。 將轉基因顯微注射到BDF1 小鼠受精卵的原核中并培育出穩定的Hcrt/Arch 轉基因品系,黃色光敏Arch-3 質子泵在Hcrt 神經元中發揮特異性抑制作用。 利用抗EGFP 抗體進行免疫組織化學雙標,證實Arch 在Hcrt 神經元中的表達。 通過對該模型小鼠進行光照可以誘導潛伏期較短的睡眠,但誘導效果與轉基因表達程度有關。 高水平Arch 表達影響了Hcrt 神經元興奮性,模型小鼠表現出REM/NREM 潛伏期縮短,REM 睡眠延長,覺醒時間減少。 Hcrt/Arch 小鼠允許對Hcrt 神經元進行短期、可逆的操作,便于評估Hcrt 神經回路的特定方面及Hcrt 激活或抑制的后果。

5 免疫介導模型

5.1 脂多糖誘導的CCR3 基因敲除模型

趨化因子受體3(chemokine receptor 3, CCR3)是與發作性睡病相關的易感基因,其在發作性睡病患者外周血中的表達水平降低[44]。 CCR3 作為一種G 蛋白偶聯受體,調節免疫細胞的定位及炎癥細胞分泌的趨化因子梯度,在中樞神經系統中作為炎癥介質發揮作用[45]。 Toyoda 等[46]發現與WT 小鼠相比,CCR3 基因敲除小鼠的Hcrt 神經元數量減少約10%,未產生發作性睡病的表現。 進一步使用革蘭氏陰性菌外膜的主要結構成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為免疫系統刺激物,腹腔注射入CCR3 基因敲除小鼠,小鼠出現REM 睡眠時間延長,NREM 睡眠時間縮短而發作次數增加。多項研究證實,LPS 能在給藥后24 h 內改變嚙齒動物的睡眠-覺醒模式[47-49]。 LPS 誘導的CCR3 基因敲除小鼠適用于研究由環境觸發因素引起免疫介導的Hcrt 神經元退化,來理解發作性睡病的免疫發病背景。

5.2 CD8+T 介導的Hcrt 神經元損傷模型

發作性睡病與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)等位基因HLA-DQB1*06:02 密切相關,98.4%的患者攜帶該基因,在發作性睡病患者的血清和腦脊液中已發現識別中樞神經系統表達不同抗原靶點的自身抗體[50-52]。 Bernard-Valnet 等[53]培育了在Hcrt 能神經元(稱為Orex-HA)中特異性表達血凝素(hemagglutinin, HA)作為“新自身抗原”的小鼠,將Rosa26tm(HA)1lib 小鼠與Orex-Cre 小鼠雜交,在人食欲素啟動子的控制下表達Cre,通過定量RT-PCR 方法檢測評估HA 在Orex-HA 小鼠大腦不同部位的轉錄情況。 然后將自身抗原特異性的CD8+T(CTL)細胞注射到Orex-HA小鼠體內,組織學分析顯示Orex-HA 小鼠下丘腦有密集的T 細胞浸潤,在移植后第5 ～8 天達到高峰。15 d 后再次接受CTL,迅速出現明顯的發作性睡病表型,包括猝倒發作,REM 潛伏期縮短、時間延長,覺醒次數減少。 CTL 與表達MHC-I 類Hcrt 神經元直接相互作用,導致細胞溶解顆粒極化,反復注射CTL 后,這種表型進一步加重[54]。 該模型適用于發作性睡病的自身免疫發病機制研究,且為探究免疫療法提供了理論基礎。

6 總結

NRL 是一種具有遺傳易感性、受環境因素影響或觸發的疾病,發病機制復雜。 動物模型是研發和測試新的NRL 療法的基礎。 目前已開發的動物模型主要通過基因工程或化學誘導等方法,造成下丘腦外側區Hcrt 神經元特異性喪失,以模擬人類NRL的病理表現和臨床特征,但由于實驗動物與人類在基因調控、器官結構與細胞類型等存在一定差別,這些模型對NRL 治療靶點的預測能力有限,仍需進一步驗證。 如在O/E3 轉錄因子缺失模型中,通過靜脈注射Hcrt-1 可逆轉NRL 表型,但對于人類NRL患者使用Hcrt 神經肽并不可行,因其很難穿越血腦屏障[55]。 NRL 治療發展的最終目標應是研發出一種針對該病病因,即自身免疫介導的下丘腦外側區Hcrt 神經元退化。 因此,可進一步構建由自身免疫介導的NRL 動物模型,更準確地了解免疫系統對NRL 患者Hcrt 系統毀損的病理機制,從而為預防、治療或阻止NRL 的發作提供相應的治療靶點。

綜上,雖然目前的動物模型不能完全概括人類發作性睡病的所有特征,但在揭示發作性睡病復雜病理機制及潛在治療策略等方面,動物模型發揮了關鍵作用。 需要強調的是,動物模型應是人體復雜系統的簡單表示,模擬疾病的特定方面,而決不是試圖復制人類疾病的所有復雜性。 每個模型的優勢很大程度上取決于該模型的評估目的,未來仍需基于研究目的繼續探索更合適的動物模型。