青光安Ⅱ號方有效組分對慢性高眼壓DBA/2J 小鼠視網膜神經節細胞的保護作用及機制

曾志成，李銀鑫，秦惠鈺，蔣鵬飛，彭 俊*，彭清華*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南桂陽縣第一人民醫院，湖南 郴州 424400；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

青光眼是一組以視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells, RGCs）進行性凋亡及視神經纖維的丟失為特征的神經退行性疾病[1]。 目前，對于青光眼的治療以降低眼壓為主，但即使控制眼壓仍不能完全阻止青光眼患者視神經的持續性損傷和退行性改變[2]。 本團隊前期研究發現，青光安Ⅱ號方對眼壓已控制的青光眼患者的視神經能起到一定的保護作用[3]，并通過高通量篩選體系多模式（水提醇提-溶劑分配分離-大孔樹脂） 提取分離手段得到了青光安Ⅱ號方的有效組分[4]。 為明確青光安Ⅱ號方有效組分對青光眼視神經的保護作用及機制，本研究將青光安Ⅱ號方有效組分配制成低、中、高3 種梯度劑量作用于青光眼模型DBA/2J 小鼠，以驗證其是否具有抑制RGCs 凋亡、保護視神經的作用，同時對其保護視神經的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只10 周齡SPF 級DBA/2J 小鼠，雌性，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，質量合格證號：No.1100111911055898；20 只10 周齡SPF 級野生型C57BL/6J 小鼠，雌性，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002，質量合格證號：1107271911002463。動物飼養于湖南中醫藥大學科技創新中心實驗動物中心屏障環境實驗室，實驗動物使用許可證號：SCXK（湘）：2019-0009，飼養過程維持相同實驗條件，光/暗周期為12 h/12 h（光照時間6:00～18:00），背景噪聲為（40±10） db，溫度（23±3） ℃，動物飼料為標準化顆粒飼料，動物自由進食、進水。 動物飼養和實驗操作遵循美國視覺和眼科研究學會（Association for Reearch in Vision and Ophthalmology, ARVO）和湖南中醫藥大學制定的科研動物和實驗室使用規范。實驗經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（LL2019100802）。

1.1.2 實驗藥物 青光安Ⅱ號湯劑由枸杞子、黃芪、女貞子等道地藥材按規定比例用滅菌蒸餾水制成懸混液；基于團隊前期中藥高通量篩選體系[5-6]對青光安Ⅱ號方中藥組分庫的篩選，提取出青光安Ⅱ號方有效組分懸混液。 益脈康分散片：湖南湘雅制藥有限公司，規格：400 mg/片，批號：1903119。

1.1.3 主要實驗試劑 蘇木素染液（批號：G1004）、伊紅染液（批號：G1001）、Proteinase K（批號：G1234）、檸檬酸抗原修復液（批號：G1202）、麗春紅染液（批號：G2011）、HRP 標記-山羊抗兔二抗（批號：GB23301）、BCA 蛋白定量檢測試劑盒（批號：G2026），均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗糖原合酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）多克隆抗體（批號：bs-0023M）、兔抗β-連環蛋白（β-Catenin）多克隆抗體（批號：bs-1165R）、兔抗同源盒基因-6（Paired box gene-6, Pax6）多克隆抗體（批號：bs-11204R）、兔抗β-Actin 多克隆抗體（批號：bs-0016R），均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.4 主要實驗儀器 Tono-pen AVIA 型筆式眼壓計（美國Reichert 公司）；SL-2G 型裂隙燈顯微鏡（日本Topcon 公司）；Micron Ⅳ型小動物視網膜影像系統（美國Phoenix Research Labs 公司）；SK3300H 型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；RM2235 型石蠟輪轉切片機（德國Leica 公司）；RT-2100C 型酶標檢測儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Neofuge 13R 型臺式高速冷凍離心機（香港力康生物醫療科技控股有限公司）；MX-F 型渦旋混合器、TSY-B 型脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司）；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳儀、DYCZ-40D 型轉印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；alphaEaseFC 灰度分析軟件（美國Alpha Innotech 公司）；Adobe PhotoShop 圖像分析軟件 （美國Adobe公司）。

1.2 方法

1.2.1 眼壓測量 所有動物適應性飼養3 d 后開始測量眼壓，在小鼠清醒狀態下由兩人配合使用Tonopen AVIA 接觸式眼壓筆每4 周測量1 次，測量時間為早上9:00 至12:00。 取連續10 次測量的平均值（且LCD 上顯示置信指標≥95）作為該眼眼壓值。

1.2.2 實驗分組與給藥 DBA/2J 小鼠從28 周齡開始眼壓逐漸升高，28～44 周齡持續高眼壓，56 周齡眼壓開始降低[7]，本實驗將38 周齡的DBA/2J 小鼠初步納入慢性高眼壓青光眼模型組，由于DBA/2J小鼠高眼壓在個體中存在一定差異，在同年齡段不同小鼠、同小鼠不同眼別眼壓升高進程不平衡[8]，根據DBA/2J 小鼠38 周齡時平均眼壓和標準差，剔除眼壓值平均值在±3 mmHg 范圍以外的DBA/2J小鼠。

第38 周齡時，從C57BL/6J 小鼠中隨機選取8只（30 眼）納入組成正常對照組（A 組）；在剔除后剩余的DBA/2J 小鼠中選取48 只（180 眼），按照隨機數字表法平均分為青光眼模型組（B 組）、益脈康分散片組（C 組）、青光安Ⅱ號方湯劑組（D 組）、青光安Ⅱ號方有效組分低劑量組（E 組）、青光安Ⅱ號方有效組分中劑量組（F 組）、青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組（G 組）。藥物均用蒸餾水作為溶劑進行配制，各組小鼠給藥藥物配制濃度、給藥劑量見表1。

表1 各組小鼠給藥藥物配制濃度及給藥劑量

1.2.3 取材方法 灌胃4 周后，各組小鼠行頸椎脫臼處死，仔細剝離小鼠眼球，一只置于裝有2.5 mL FAS 眼球固定液的EP 管中，固定25 min 后，取出眼球，沿角鞏膜緣剪開，除去角膜、虹膜、晶狀體，制作成含視網膜的眼杯，放入FAS 眼球固定液中繼續固定48 h，石蠟包埋切片，備行HE 染色、TUNEL 染色、免疫組化染色。 另一只眼球置于冰盤上，用眼科顯微器械沿角鞏膜緣剪開，除去角膜、虹膜、晶狀體，迅速剝離出視網膜組織，置入EP 管中，再放入液氮罐中保存，備行Western blot 檢測。

1.2.4 視網膜石蠟切片標本制作 采用80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ分別脫水10～15 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明10～15 min；56 ℃石蠟浸蠟1 h。浸蠟后的眼杯水平切面朝向包埋盒底，58～60 ℃硬蠟包埋，蠟塊冷卻后，室溫保存待切；用輪轉式切片機切片，靠近視乳頭的位置開始切片，厚約4 μm，每個眼杯至少切取3 張切片包含有視網膜，40～46 ℃水浴，放在水上展平切片；把切片置于載物片的三分之一處，撈于載物片中央，晾干，放在切片盒內，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.5 視網膜HE 染色 取出各組小鼠視網膜組織切片，每張視網膜選取一張切片，400 倍鏡下拍照。

1.2.6 視網膜RGCs 凋亡檢測 取出各組小鼠視網膜石蠟切片，每張視網膜選取一張切片，根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書的操作步驟進行。 細胞核固縮、胞漿濃縮，細胞核呈棕褐色為陽性細胞，每張切片隨機選取1 個視野（×400）拍照，計數視野中陽性著色RGCs 數目，計算出RGCs 細胞的凋亡指數（凋亡指數=陽性細胞數/RGCs 總細胞數×100%），取平均值。

1.2.7 視網膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6 蛋白表達半定量檢測 取出各組小鼠視網膜石蠟切片，每張視網膜選取3 張切片，每張切片用于檢測1 個蛋白，根據通用二步法試劑盒中說明書操作步驟進行。胞漿、細胞核及細胞膜之一出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，每張切片隨機選取1 個視野（×400）拍照。 重點觀察每張切片上神經節細胞層細胞染色情況。

1.2.8 視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達定量檢測 取出各組小鼠視網膜組織，每組每2 張視網膜組織為1 個樣本，共檢測4 個樣本。 步驟如下：（1）將每個視網膜組織勻漿、裂解，后轉移至離心管中，移至臺式高速冷凍離心機中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min（半徑95 mm），離心后取上清并轉移至1.5 mL 新的離心管中，保存于-20 ℃備用。 （2）蛋白濃度測定：用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。（3）制備Western blot 實驗用蛋白樣品。（4）SDSPAGE 電泳。（5）轉膜。（6）染色、封閉。（7）孵育一抗：先用封閉液稀釋各指標一抗（兔抗-GSK3β、兔抗-β/Catenin、兔抗-Pax6 及兔抗β-Actin 多克隆抗體，均按照1∶1000 稀釋），然后棄去封閉袋中的封閉液，加入稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。 （8）孵育二抗。 （9）將條帶放在保鮮膜上，設定曝光時間進行曝光、拍照。采用AlphaEaseFC 軟件分析系統進行灰度值分析各目標蛋白的灰度值，以β-Actin 蛋白灰度值作為內參，二者比值即為灰度值，表示蛋白表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 C57BL/6J 小鼠與DBA/2J 小鼠眼壓

20 只（40 眼）C57BL/6J 小鼠在10～38 周齡眼壓一直波動在10～16 mmHg。 100 只（200 眼）DBA/2J小鼠在10 周齡和34 周齡測量眼壓時，分別有1 只小鼠死亡，死亡小鼠當周雙眼眼壓數據即開始不納入統計范圍內。DBA/2J 小鼠眼壓在10～22 周齡之間逐漸上升。 詳見圖1。

圖1 C57BL/6J 小鼠和DBA/2J 小鼠10～38 周齡不同時相點眼壓

2.2 各組小鼠視網膜形態結構

A 組小鼠視網膜各層結構清晰、完整、染色均勻，清晰可見3 個核層，由內向外依次為GCL、內核層（inner nuclear layer, INL）以及外核層（outer nuclear layer, ONL）；神經節細胞呈單層排列，比較連續無間斷，細胞大小不一，呈圓形或橢圓形，INL 及ONL細胞呈多層分布，內叢狀層（inner plexiform layer, IPL）位于GCL 與INL 之間，外叢狀層（outer plexiform layer,OPL）位于INL 與ONL 之間。 B 組以GCL 損傷最為明顯，神經節細胞明顯減少，連續性中斷，胞內空泡樣變性，核固縮。 C 組、D 組、E 組、F 組、G 組神經節細胞數目增多，胞內空泡樣變性改變均有所改善，以C 組、D 組、F 組、G 組較為明顯。 詳見圖2。

圖2 各組小鼠視網膜組織結構（HE，×400）

2.3 各組小鼠視網膜RGCs 凋亡情況

A 組小鼠視網膜呈現核固縮的細胞較少；B 組在GCL、INL 及ONL 層均可見大量核固縮細胞，TUNEL 染色呈現棕褐色且為深染，視網膜厚度明顯變薄；C 組、D 組、F 組、G 組核固縮和TUNEL 陽性細胞數目減少，且為淺染。 詳見圖3。

圖3 各組小鼠視網膜神經節細胞層RGCs 凋亡情況（Tunel，×400）

與A 組比較，B 組凋亡指數明顯升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E 組、F 組、G 組凋亡指數均明顯降低（P＜0.01）；與C 組或D 組比較，E 組凋亡指數升高（P＜0.05 或P＜0.01），G 組凋亡指數明顯降低（P＜0.01）。 詳見圖4。

圖4 各組視網膜神經節細胞層凋亡指數比較

2.4 各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6免疫組化染色情況

GSK-3β、β-Catenin 和Pax6 蛋白在小鼠視網膜的表達主要位于神經節細胞層，在內核層也可以見到其少許表達，在神經節細胞層，其表達主要位于細胞質和細胞膜。 與A 組比較，B 組視網膜GSK-3β表達量明顯升高（P<0.01），β-Catenin 和Pax6 表達量明顯降低（P<0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E組、F組、G 組GSK-3β 表達量均明顯降低（P<0.01），C 組、D 組、F 組、G 組β-Catenin 表達量均有升高（P<0.05或P<0.01），C 組、D 組、F 組、G 組Pax6 表達量均有升高（P<0.05 或P<0.01）；與C 組和D 組比較，G 組GSK-3β 表達量降低（P<0.05），β-Catenin 和Pax6 表達量升高（P<0.01）。 詳見圖5 至圖7、表2。

表2 各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達量比較（±s，n=4）

表2 各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達量比較（±s，n=4）

注：與A 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與B 組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與C 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與D 組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組G 組F 值P 值GSK-3β 0.30±0.06 0.85±0.07◆◆0.62±0.09◆◆●●0.60±0.05◆◆●●0.58±0.06◆◆●●0.46±0.11◆◆●●0.42±0.03◆●●▲★★24.280 0.000 β-Catenin 0.78±0.13 0.20±0.08◆◆0.28±0.07◆◆●0.31±0.08◆◆●0.32±0.06◆◆0.35±0.07◆◆●●0.41±0.04◆◆●●▲▲★★22.204 0.000 Pax6 0.83±0.13 0.25±0.05◆◆0.36±0.07◆◆●●0.37±0.04◆◆●0.39±0.08◆◆0.42±0.10◆◆●●0.49±0.05◆◆●●▲▲★★21.330 0.000

圖5 各組視網膜GSK-3β 蛋白表達（免疫組化，×400）

圖7 各組視網膜pax6 蛋白表達（免疫組化，×400）

2.5 各組視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達量

圖6 各組視網膜β-Catenin 蛋白表達（免疫組化，×400）

與A 組比較，B 組視網膜GSK-3β 表達量明顯升高（P<0.01），β-Catenin 和Pax6 表達量明顯降低（P<0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E 組、F 組、G 組GSK-3β 表達量均明顯降低（P<0.01），C 組、D 組、G 組β-Catenin 表達量均有升高（P<0.05 或P<0.01），C組、D 組、F 組、G 組Pax6 表達量均有升高（P<0.05或P<0.01）；與C 組和D 組比較，G 組GSK-3β 表達量降低（P<0.05），β-Catenin 和Pax6 表達量升高（P<0.01）。 詳見圖8、表3。

圖8 各組視網膜GSK-3β、β-catenin 及Pax6 蛋白電泳圖

表3 各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達量比較（±s，n=4）

表3 各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達量比較（±s，n=4）

注：與A 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與B 組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與C 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與D 組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組G 組F 值P 值GSK-3β 0.25±0.04 0.70±0.10◆◆0.50±0.08◆◆●●0.52±0.07◆◆●●0.54±0.09◆◆●●0.49±0.08◆◆●●0.38±0.05◆●●▲★14.099 0.000 β-Catenin 0.73±0.07 0.15±0.04◆◆0.25±0.03◆◆●0.26±0.05◆◆●0.20±0.04◆◆0.22±0.03◆◆0.48±0.09◆◆●●▲▲★★54.220 0.000 Pax6 0.64±0.10 0.16±0.04◆◆0.30±0.06◆◆●●0.28±0.06◆◆●0.24±0.05◆◆0.33±0.07◆◆●●0.48±0.08◆◆●●▲▲★★21.205 0.000

3 討論

DBA/2J 小鼠是一種年齡相關性高眼壓青光眼視神經損傷模型，在一定時期內隨著年齡的增長眼壓逐漸升高，升高的眼壓導致視網膜神經節細胞凋亡和軸突變性。 它是由于GPNMB 和TYRP1 基因突變[9]導致虹膜脫色素、虹膜萎縮，脫落的色素和細胞碎片聚集在房水外流通道中，導致房水外流受阻，引起高眼壓，繼而產生視網膜神經節細胞凋亡、視盤神經纖維層變薄以及視盤變大等視神經損害。 SHELDON 等[10]于1995 年首次對其進行了描述，該青光眼模型具有自然性、年齡相關性及進展性，類似人類青光眼發病方式，所以在青光眼實驗研究中得以廣泛使用，特別是在探討壓力相關性視神經節細胞凋亡、視神經變性機制[11-12]和評估視神經保護藥物療效[13]等方面。 DBA/2J 小鼠的眼壓增高程度具有一定的個體化差異，本研究發現，DBA/2J 小鼠38 周齡時，98 只（196 眼）眼壓波動范圍在16～37（23.47±2.44） mmHg，進行離群值取舍后判定眼壓波動范圍在16.15～30.79 mmHg 之間，故將眼壓<16.15 mmHg和>30.79 mmHg 的DBA/2J 小鼠予以剔除。

Wnt/β-Catenin 信號通路主要由Wnt 家族分子等組成的配體[14]，包括卷曲蛋白（frizzlled, FZ）、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6, LRP-5/6）等跨膜受體，GSK-3β、結腸腺瘤樣息肉病基因產物（adenomatous polyposis coli, APC）、蓬亂蛋白（dishevelled, Dsh）、β-Catenin、軸蛋白（Axin）等調節蛋白及轉錄因子TCF/LEF 家族等組成。 當存在分泌的Wnt 蛋白時，細胞外Wnt 蛋白與細胞膜上的FZ/LRP 受體結合啟動Wnt/β-Catenin 信號，然后通過磷酸化并激活細胞漿內的Dsh 蛋白，抑制GSK-3β/APC/Axin 復合物對β-Catenin 的磷酸化，胞漿內β-Catenin 累積并穩定后會轉移至細胞核與TCF/LEF 家族的轉錄因子結合，促進下游Pax6、Ngn2、c-myc、cylinD1 等靶基因的表達，這些基因多是參與細胞增殖、凋亡調控的基因[5]。 在沒有Wnt 蛋白存在或者GSK-3β 活化過度時，GSK-3β/APC/Axin 復合物在GSK-3β 的作用下將降解β-Catenin，而不能引起下游相關靶基因的表達，使Wnt/β-Catenin 信號通路處于抑制或關閉狀態，因此，GSK-3β 是許多神經退行性疾病的關鍵調節因子[15]。

青光眼作為一種眼部神經退行性疾病，病理機制與其他神經退行性疾病相似，存在神經元Tau 蛋白磷酸化異常、軸漿轉運障礙、凋亡及變性等病理改變[16-18]。 在慢性高眼壓病程中伴隨有GSK-3β 活化的危險因素，比如視網膜的缺血缺氧、DNA 損傷、神經營養因子缺乏、β 淀粉樣蛋白異常沉積等[19-21]。 研究也證實，慢性高眼壓可引起視網膜視神經GSK-3β活化與過度表達[22]，使視網膜視神經Wnt/β-Catenin信號通路處于抑制狀態，包括Pax6 在內的下游靶基因表達將可能受到抑制，而Pax6 靶基因可以通過上調Math5 和Brn3b 蛋白水平，可以促使胚胎干細胞分化形成視網膜神經節樣細胞[23]，參與細胞增殖、凋亡調控。 通過抑制GSK-3β 過度活化，促使β-Catenin表達與向核內轉移，可以促進Wnt/β-Catenin 信號通路激活，從而達到保護神經系統，延緩神經退行性疾病病程進展的目的[24-26]。

青光眼的疾病特征就是進行性RGCs 死亡和神經纖維喪失，凋亡是RGCs 死亡的主要途徑[1]。SCHUETTAUF 等[27]用TUNEL 法標記凋亡的RGCs，發現DBA/2J 小鼠RGCs 凋亡峰時出現在6 月齡。 而楊帆等[28]用Nissl 染色標記法追蹤DBA/2J 小鼠RGCs丟失情況，發現RGCs 丟失從7 月齡開始，高峰時在9～11 月齡，14 月齡RGCs 僅零星可見。 觀察到的DBA/2J 小鼠RGCs 凋亡高峰時間不同可能是由于他們采取了不同的研究方法所致。 本研究選取38 周齡的DBA/2J 小鼠作為青光眼視神經損傷模型，通過TUNEL 法標記凋亡的RGCs，發現38 周齡DBA/2J小鼠凋亡指數達到55.86%±8.53%，明顯高于正常對照組（P<0.01）。 進一步說明了DBA/2J 小鼠自38周齡后具有顯著的RGCs 凋亡特征，是理想的青光眼視神經損傷模型，對于評估視神經保護藥物的療效是可行的。 采用益脈康分散片、青光安Ⅱ號方、青光安Ⅱ號方有效組分低、中、高劑量干預青光眼模型DBA/2J 小鼠4 周，發現益脈康分散片、青光安Ⅱ號方湯劑、青光安Ⅱ號方有效組分低中、高劑量均能夠明顯延緩或阻止DBA/2J 小鼠RGCs 的凋亡；其中青光安Ⅱ號方有效組分高劑量對DBA/2J 小鼠RGCs的凋亡抑制作用明顯優于益脈康分散片和青光安Ⅱ號方湯劑。

GSK-3β 和β-Catenin 是Wnt/β-Catenin 信號通路中的兩個關鍵信號蛋白分子[29]，GSK-3β 活化過度時，GSK-3β/APC/Axin 復合物在GSK-3β 的作用下將降解β-Catenin，不能引起下游Pax6 等靶基因的表達。 通過Western blot 檢測各組小鼠視網膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6 蛋白表達量發現，與正常對照組C57BL/6J 小鼠比較，青光眼模型組GSK-3β 在視網膜表達水平明顯升高，β-Catenin 和Pax6在視網膜表達水平明顯降低（P<0.01），說明38 周齡后DBA/2J 小鼠視網膜Wnt/β-Catenin 信號通路處于抑制狀態，下游Pax6 基因同樣難以表達。 益脈康分散片、青光安Ⅱ號方、青光安Ⅱ號方有效組分個劑量組干預青光眼模型組DBA/2J 小鼠4 周后，發現益脈康分散片、青光安Ⅱ號方湯劑、青光安Ⅱ號方有效組分高劑量均能激活DBA/2J 小鼠視網膜Wnt/β-Catenin 信號通路相關蛋白及下游Pax6 基因表達，且青光安Ⅱ號方有效組分高劑量組的作用更為明顯。

本實驗驗證了青光安Ⅱ號方有效組分高劑量具有明顯抑制青光眼動物模型RGCs 細胞凋亡、保護視神經的作用，其作用與激活Wnt/β-Catenin 信號通路和下游Pax6 基因表達關系密切。 在后期研究中，本團隊將采用UPLC-Q-TOF 法，結合相關文獻和化合物質譜信息，分析鑒定出該有效組分的相關化學成分，為治療青光眼的中藥新藥的研發提供基礎。