參苓白術散調節AMPK、ABCG2 改善高尿酸血癥模型小鼠尿酸的實驗研究

汪永輝，蕭 閔*，李 瑛，馬 瓏，江曉翠，王 嵐，龔 健，王武勝

（1.湖北中醫藥大學黃家湖醫院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫藥大學中醫藥實驗中心，湖北 武漢 430065；3.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

高尿酸血癥（hyperuricemia, HUA）是內源性嘌呤代謝紊亂引起機體尿酸鹽結晶析出，沉積于身體各部位，損傷機體功能的代謝異常綜合征。臨床最常見的表現為尿酸鹽結晶沉積于關節，誘發痛風；并且血清長期高尿酸（uric acid, UA）狀態也是糖尿病、高血壓、慢性腎病、腦卒中等多種疾病發生發展的重要誘因[1-2]。 UA 排泄異常是HUA 主要發病機制，故影響UA 轉運的蛋白是治療HUA 的靶向分子之一。ATP 結合盒轉運體G2（ATP-binding cassette transporter G2, ABCG2）是一類跨生物膜運輸的蛋白，可利用ATP 水解釋放的能量將細胞內UA 產物排出[3-4]。ABCG2 表達受AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）調節，有報道發現，通過AMPK/CREB 信號通路可影響ABCG2 表達，從而緩解2型糖尿病小鼠的HUA[5]。 因此，調節ABCG2/AMPK 通路改善UA 沉積是治療HUA 的有效途徑。

參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾、滲濕止瀉的功效。 臨床運用顯示，其能改善HUA 痛風性關節炎[6]，治療間歇期痛風性關節炎[7]，調節血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、C 反應蛋白、UA 及紅細胞沉降率，改善關節腫脹及疼痛狀況[8]。目前，尚無相關動物實驗報道，并且是否能通過AMPK/ABCG2 改善UA 沉積尚不清楚。 本實驗通過觀察參苓白術散對HUA 小鼠模型血清UA 及腸組織AMPK、ABCG2 蛋白的影響，初步探索參苓白術散降UA 的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性昆明小鼠36 只，體質量18～22 g，購于三峽大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。 飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2017-0067，飼養環境：溫度為（22±2） ℃，相對濕度為50%～70%，適應性喂養1周。本實驗操作嚴格遵守動物福利相關規定，由湖北中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，倫理審批號：HUCMS202111013。

1.2 藥物與試劑

參苓白術散組成：黨參10 g，茯苓10 g，炒白術10 g，山藥10 g，炒白扁豆7.5 g，蓮子5 g，炒薏苡仁5 g，砂仁5 g，桔梗5 g，甘草10 g。生藥均購自湖北中醫藥大學黃家湖醫院，統一煎煮成生藥含量為1 g/mL 的湯劑。 非布司他片（杭州朱養心藥業有限公司，批號：20210805）。

氧嗪酸鉀（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：YZLCP0016）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：CP300-800）；UA（批號：GM1110）、谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase, ALT，批號：GM1102）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase,AST，批號：GM1103）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；CysC ELISA 檢測試劑盒（批號：PC215）、RIPA 裂解液（批號：P0013B）、超敏電化學發光顯影液（批號：P0018S-2）均購自上海碧云天生物技術有限公司；GAPDH（批號：P0018S-2）、兔多抗磷酸化的AMPK（phosphorylated AMPK, p-AMPK）抗體（批號：bs-3026R）、兔多抗ABCG2 抗體（批號：bs-0662R）均購自北京博奧森生物有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司，批號：G2026-200T）；總RNA 提取試劑盒（批號：TSP413）、逆轉錄互補DNA 試劑盒（批號：TSK313S）、PCR 試劑盒（批號：TSE202）均購自北京擎科公司。 小鼠AMPK、ABCG2 引物均由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。 詳見表1。

表1 引物序列

1.3 主要儀器

高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：KZ-III-F）；冷凍高速離心機（日本日立公司，型號：CR21G）；電轉儀（北京六一儀器廠，型號：DYCZ-40）；RT-qPCR 儀（美國ABI 公司，型號：5900）；顯微鏡（型號：E100）、成像系統（型號：NikonDS-U3）均購自日本尼康公司；全自動生化儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：Chemray 800）。

2 方法

2.1 動物造模、分組及給藥方法

36 只小鼠，隨機分成4 組：空白組、模型組、中藥組、西藥組。空白組除外，其余各組每天腹腔注射氧嗪酸鉀懸液0.6 g/kg，連續7 d，血清UA 升高提示造模成功[9]。 造模完成后，根據人給藥劑量，1 劑/d（1 劑生藥為77.5 g），配制1 g/mL 的參苓白術散懸液。按照小鼠與成人的體表面積換算公式[10]計算，中藥組給予參苓白術散5 g/kg 灌胃，西藥組給予非布司他0.25 g/kg 灌胃，空白組、模型組均給予生理鹽水0.1 mL/kg。 各組均干預14 d。

2.2 取材方法

取材前12 h 禁食不禁水，末次給藥1 h 后，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，心臟采血，室溫靜置1 h后，3000 r/min、半徑13 cm、4 ℃離心10 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱內冷凍保存。

小鼠安樂死后，快速剝離左葉肝、左側腎、回腸組織，生理鹽水沖洗干凈，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分組織，經液氮速凍后，置于-80 ℃低溫冰箱內保存。

2.3 生化法檢測血清UA

取4 μL 血清，加入250 μL 反應試劑，波長510 nm，上機，全自動生化儀自動測定UA。

2.4 ELISA 法檢測血清CysC 含量

取血清，嚴格按照ELISA 試劑盒步驟操作，每孔50 μL 血清，依次加入標準品、加樣加酶、溫育、洗滌、顯色、每孔加終止液50 μL，終止反應，450 nm波長依序測量各孔的光密度值，根據標準曲線，計算CysC 蛋白濃度。

2.5 HE 染色法檢測腎、回腸組織病理變化

取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的腎、回腸組織，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；5 μm切片、脫蠟，HE 染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.6 Western blot 檢測回腸組織AMPK、p-AMPK、ABCG2 蛋白表達

取50 mg 回腸組織，加入1 mL RIPA 裂解液及PMSF 蛋白酶抑制劑，高速組織研磨儀勻漿后置于冰上反應30 min，10 000 r/min、半徑13 cm 離心15 min，取上清液蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品。SDS-PAGE 電泳后濕轉法轉膜，10%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，TBST 洗膜3 次，加入兔多抗ABCG2、p-AMPK 于4 ℃冰箱內孵育過夜，次日辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，超敏電化學發光液顯影。采用Image J 圖像處理軟件計算出目標蛋白和內參GADPH 對應條帶灰度值的比值，統計分析。

2.7 RT-qPCR 檢測回腸組織ABCG2 mRNA 表達

取50 mg 回腸組織，加Trizol 1 mL 提取總RNA，超微量分光光度計測定RNA 濃度。 采用第一鏈互補DNA 合成試劑盒將RNA 轉錄為互補DNA，反應條件：25 ℃，5 min；52 ℃，15 min；83 ℃，5 min；4 ℃，10 min。 取稀釋5 倍的互補DNA 4 μL，加入上、下游引物各0.2 μL，進行RT-qPCR，40 個循環。 繪制擴增曲線熔解曲線，結果采用2－△△Ct計算分析。

2.8 安全性評估

2.8.1 HE 染色觀察肝病理變化 取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的肝組織，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；5 μm 切片、脫蠟，HE 染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.8.2 生化法檢測肝功能 取12 μL 血清，加入240 μL 反應試劑，波長340 nm，上機，全自動生化儀自動測定AST；取12 μL 血清，加入240 μL 反應試劑，波長340 nm，上機，全自動生化儀自動測定ALT。

2.9 統計學方法

圖片分析采用Image Pro Plus 5 軟件分析，數據采用SPSS 21.0 軟件分析。 計數資料以“±s”表示，數據先進行正態及方差齊性檢測，若兩項皆符合，采用單因素方差（ANOVA）分析；若數據不符合正態分布或者方差不齊，采用非參數檢驗。 以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 參苓白術散對血清UA、CysC 的影響

與空白組比較，模型組UA、CysC 含量均顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，西藥組和中藥組UA 含量顯著降低（P＜0.01）；中藥組CysC 含量顯著降低（P＜0.01）。西藥組CysC 含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 中藥組UA、CysC含量與西藥組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖1。

圖1 參苓白術散對各組小鼠血清UA、Cysc 水平的影響

3.2 參苓白術散對回腸、腎組織病理變化的影響

空白組，腎小球大小均勻，腎小管結構清晰，邊界明顯，上皮細胞形態正常；模型組，腎間質有炎性細胞浸潤，腎小球未見明顯萎縮，腎小管結構可見，上皮細胞輕微脫落；中藥組及西藥組上皮細胞脫落癥狀有所改善。 詳見圖2。

圖2 參苓白術散對各組小鼠腎組織的影響（HE 染色）

空白組回腸組織黏膜皺襞規則，腸絨毛完整、整齊、密集；模型組腸絨毛存在大量炎細胞團，腸絨毛短小，隱窩深度變淺，腸黏膜上皮細胞出現不同程度損傷；與模型組比較，中藥組腸絨毛完整，排列較為稀疏，炎性細胞浸潤和腸黏膜上皮細胞損傷有所改善；西藥組炎性細胞浸潤改善，腸黏膜上皮細胞損傷，微絨毛壞死脫落，未見明顯好轉。 詳見圖3。

圖3 參苓白術散對各組小鼠回腸組織的影響（HE 染色）

3.3 參苓白術散對回腸組織p-AMPK、ABCG2 蛋白的影響

與空白組比較，模型組p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均顯著降低(P＜0.01)。 與模型組比較，中藥組和西藥組p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均顯著升高(P＜0.01)。 詳見圖4。

圖4 參苓白術散對各組小鼠回腸組織p-AMPK、ABCG2 蛋白的影響

3.4 參苓白術散對回腸組織ABCG2 mRNA 的影響

與空白組比較，模型組ABCG2 mRNA 含量顯著降低（P＜0.01)。 與模型組比較，中藥組和西藥組ABCG2 mRNA 均顯著升高（P＜0.01)。 詳見圖5。

圖5 參苓白術散對各組小鼠回腸組織ABCG2 mRNA表達的影響

3.5 參苓白術散藥物安全性的評估

3.5.1 對肝功能的影響 各組間血清ALT、AST 比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖6。

圖6 參苓白術散對各組小鼠血清AST、ALT 水平

3.5.2 對肝組織病理的影響 肝板的細胞排列緊密，肝小葉結構清晰，從整體來看肝竇無規律性擴張。詳見圖7。

圖7 各組小鼠肝組織病理變化（HE 染色，×40）

4 討論

隨著飲食結構及生活方式的改變，HUA 發病率呈逐年升高趨勢[11]。 HUA 和痛風有明確的因果關系，是同一種疾病的不同病理過程[12]。 HUA 可引起急性痛風性關節炎、痛風石沉積、痛風石性慢性關節炎和關節畸形、UA 性腎病等，嚴重危害患者健康。

早期HUA 無臨床癥狀，通過血清UA 判定其發病，中醫學尚無明確辨證體系。若出現一些列UA 沉積后誘發癥狀，如關節紅腫熱痛等，HUA 則歸屬“痛痹”的范疇。究其病因，為平素多食高粱肥甘厚味，致脾失運化而痰濁內生；明其病機，乃為痰阻氣血運行，而致氣滯、血瘀；反之，氣滯、血瘀，水津不布又可化生痰濁，正如李東垣《脾胃論·脾胃勝衰論》云：“百病皆由脾胃衰而生”。 《素問·至真要大論》云：“諸濕腫滿，皆屬于脾”，脾虛運化無力，則生濕邪，濕邪隨經脈、肌肉、三焦等組織泛溢于四肢百骸，從而表現出關節腫脹、疼痛等不適。 因此，HUA 中醫基本病因病機可概括為“肥甘厚味，脾失運化，諸濕腫滿”。

參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾的功效，由薏苡仁、甘草、桔梗、砂仁、白術、白茯苓、黨參、山藥組成。 方中黨參、白術、茯苓、甘草，為四君子湯，益氣健脾；加上山藥、炒白扁豆，補土生金，兼有補肺的作用；薏苡仁祛濕，砂仁暖胃，蓮子補心，陳皮燥濕，桔梗辛開宣肺，載藥上行。該方益氣健脾，針對痛痹的主要病機，具有一定療效[13]。現代藥理學研究表明，薏苡仁具有抗氧化、鎮痛抗炎藥理作用，能舒經除痹，改善關節疼痛[14]；茯苓提取出茯苓多糖及三萜類成分，具有利尿、保肝、鎮靜、提高免疫力、抗炎、抗腫瘤以及降血脂等多種藥理作用[15]，茯苓可通過緩解腎臟損傷及調節腸道菌群來促進機體內UA 的排泄進而達到降UA 的效果[16]。 因此，提示參苓白術散具有改善痛風的物質基礎。

UA 是碳、氮、氫和氧的雜環化合物，是存在于血液循環中的嘌呤代謝的氧化產物，體內的UA 水平通過其生成和排泄的平衡來維持，生成、排泄失衡是HUA 發生的根本原因[17]。 本實驗結果顯示，參苓白術散降低模型小鼠血清UA 沉積，證明參苓白術散具有調節UA 過量沉積的功能，具有防止HUA 的作用。UA 在生理pH 值下以尿酸鹽陰離子的形式存在，不能透過細胞膜，需要轉運蛋白。ABCG2 是一種在近端腎小管上排泄尿酸鹽轉運蛋白，其活性決定了細胞內UA 水平，ABCG2 也在肝和腸細胞中表達。 已有實驗證實，小鼠腸道ABCG2 的功能障礙或活性喪失會增加尿中UA 的排泄[18]。 本實驗結果顯示，參苓白術散升高模型小鼠回腸組織ABCG2 表達，降低血清UA。 ABCG2 是利用ATP 水解釋放的能量完成UA 轉運，AMPK 是促進產生ATP 的分解代謝重要途徑[19]。AMPK 激活依賴于蘇氨酸172α 環位點的磷酸化，當AMPKA 磷酸化完成，才能發揮其正常功能[20]。 本實驗結果顯示，參苓白術散影響AMPK的磷酸化，調節ABCG2 蛋白表達。

綜上所述，參苓白術散調節HUA 小鼠腸組織AMPKA 磷酸化，升高ABCG2 表達，降低血清UA 含量是治療HUA 的關鍵環節。并且本實驗通過血清肝功能、肝組織病理評估參苓白術散藥物安全性，結果顯示參苓白術散對肝功能及肝組織無影響，值得臨床推廣應用。 本研究不足之處，未能檢測AMPK通路其他相關蛋白，進一步明確參苓白術散防治HUA的機制。