加味丹玄口康通過Axin1 調節口腔上皮損傷細胞增殖活性

王宗康，譚怡絲，覃一杰，周領航，肖艷波，胡兆勇，譚 勁*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

口腔黏膜下纖維化（oral submucosal fibrosis,OSF）是一種常見的口腔癌前病變。 7%～30%的OSF患者可能患上口腔鱗狀細胞癌[1-2]。 OSF 常發生于頰黏膜、磨牙后區和軟腭部位[2-3]。 其主要癥狀包括口干、疼痛、舌頭活動受限、吞咽困難和活動性改變[3]。除了口腔，OSF 病變甚至涉及咽部和食管，嚴重影響患者的生活質量。調查研究表明，OSF 患者的患癌風險高于非OSF 患者[4]，且OSF 的患病率正逐年增加[5]。目前，OSF 的治療主要包括藥物治療、張口鍛煉和手術。對于在晚期結束手術的OSF 患者，術后仍需使用藥物輔助治療[6]。 口腔鍛煉因其低成本、方便和無創等優點，是患者最容易接受的治療手段[7]。 但其治療效果有限，需要患者自我控制。因此，尋找高效、價廉且方便的治療藥物已迫在眉睫。

加味丹玄口康（DXKK）顆粒由丹參、玄參、當歸、紅花、生地黃、白花蛇舌草、夏枯草、生黃芪、薄荷、白芍、茵陳、桔梗組成。 前期研究表明，DXKK 對OSF 的發生與發展有抑制作用[8]。 軸抑制蛋白1（axis inhibition protein 1, Axin1），分子量約95.6 kDa，是Wnt 信號通路的重要支架蛋白，且可通過β-catenin信號調節細胞的增殖活性[9-10]。 Wnt 信號通路與口腔癌病變顯著相關[11]。 在口腔癌臨床樣本中，Axin1 基因常發生突變[12]。 Axin1 可能作為口腔癌的突變靶點，參與口腔癌的發生和發展。然而，Axin1 在口腔癌前病變OSF 中的作用尚不明確。 本研究通過探究DXKK對口腔上皮損傷細胞增殖活性的影響及Axin1 的作用，旨在為DXKK 的臨床治療應用提供數據支持。

1 材料

1.1 細胞株

人口腔上皮細胞（批號：CP-H203）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。 在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的環境條件下，細胞培養于人口腔上皮細胞完全培養基中。

1.2 實驗動物

10 只健康的SD 雄性大鼠，體質量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。在自由采食、（24±3） ℃、45%～50%濕度和SPF 條件下適應性飼養1 周后，進行藥物干預處理。本研究經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準通過，審批號：LLBH-202103100002。

1.3 主要藥物與試劑

DXKK 三九顆粒制劑：丹參10 g（批號：2017003C），玄參10 g（批號：2108005C），當歸10 g（批號：2106029C），紅花5 g（批號：2103003C），生地黃10 g（批號：2108020S），白花蛇舌草10 g（批號：2101001S），夏枯草10 g（批號：2109004S），生黃芪10 g（批號：2102003C），薄荷10 g（批號：2102001C），白芍10 g（批號：2105009S），茵陳10 g（批號：2108001C），桔梗10 g（批號：2107001S），購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診三九智能顆粒中藥房。

氫溴酸檳榔堿（arecoline hydrobromide, AH，批號：300-08-3，成都德思特生物技術有限公司）；人口腔上皮細胞完全培養基（批號：CM-H203，武漢普諾賽生命科技有限公司）；過表達對照質粒（批號：2021062301）、Axin1 過表達質粒（批號：2021062302）、干擾小RNA（small interfering RNA, siRNA）陰性對照（批號：2021062308）、Axin1 siRNA-（1-3）（批號：2021062309）、RIPA 裂解液（批 號：01E220303）、脫脂奶粉（批號：12C211125）均購自長沙艾碧維生物科技有限公司；Lip 2000（批號：11668019）、Trizol（批號：343912）均購自賽默飛世爾科技有限公司；互補DNA 合成試劑盒（批號：26621，北京康為世紀生物科技有限公司）；Axin1（批號：BA04288597，北京博奧森生物技術有限公司）；β-catenin（批號：00048568）、Bax（批 號：00039968）、Bcl-2（批 號：00011619）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，批號：00086617）、β-actin（批號：10011066）、辣根過氧化酶羊抗鼠IgG（批號：20000002）、辣根過氧化酶羊抗兔IgG（批號：20000003）購自美國Proteintech 公司；Caspase-3（批號：45，美國CST公司）；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8, CCK-8，批號：NU679， 日本同仁化學研究所）；4%多聚甲醛（批號：N1012， 蘇州新賽美生物科技有限公司）；結晶紫（批號：G1062，北京索萊寶科技有限公司）；碘化丙啶（批號：MB2920，大連美侖生物技術有限公司）；EdU 檢測試劑盒（批號：U0618，廣州瑞博生物醫藥科技有限公司）。

1.4 主要儀器

倒置生物顯微鏡（型號：DSZ2000X，北京中顯恒業儀器儀表有限公司）；臺式冷凍離心機（型號：H1650R，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司）；熒光定量PCR 儀（批號：A51685，賽默飛世爾科技有限公司）；電泳儀（型號：DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）；多功能酶標分析儀（型號：MB-530，深圳市匯松科技發展有限公司）；流式細胞儀（型號：A00-1-1102，美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 質粒轉染與分組

為篩選高效抑制靶點，將口腔上皮細胞隨機分組為：空白對照組、干擾對照組（轉染siRNA 陰性對照）、Axin1 干擾-1 組（轉染Axin1 siRNA-1）、Axin1干擾-2 組（轉染Axin1 siRNA-2）、Axin1 干擾-3 組（轉 染Axin1 siRNA-3）。 siRNA 陰 性 對 照、Axin1 siRNA-1、Axin1 siRNA-2 和Axin1 siRNA-3 通 過Lip 2000 轉染至上皮細胞。 在37 ℃培養24 h 后，通過qRT-PCR 檢測Axin1 的基因表達水平。

為鑒定Axin1 對細胞增殖活性的影響，將對數期生長的細胞隨機分組為：空白對照組、干擾對照組、Axin1 干擾組、過表達對照組、Axin1 過表達組。siRNA 陰性對照、Axin1 siRNA、過表達對照質粒或Axin1 過表達質粒通過Lip 2000 轉染至上皮細胞。24 h 后，進行其他實驗分析。

2.2 qRT-PCR 檢測Axin1 的基因和mRNA 的表達水平

采用Trizol 法提取細胞中的總RNA。采用20 μL反應體系，根據HiFiScript 互補DNA 合成試劑盒說明書合成互補DNA。 以互補DNA 為模板，采用實時熒光定量PCR 檢測各組細胞中的Axin1 的基因表達水平。 其中，實時定量PCR 采用30 μL 體系，40個循環。2-ΔΔCt被用來計算RNA 表達量。Axin1 采用βactin 作為內參。 引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3 Western blot 檢測蛋白表達

采用RIPA 裂解液提取細胞中的總蛋白。 在恒壓75 V 條件下進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白。 在恒流300 mA 的條件下，蛋白被轉移到硝酸纖維素膜上。采用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃過夜。Axin1（1 ∶1000）、β-catenin（1 ∶5000）、PCNA（1 ∶3000）、Bax（1∶6000）、Bcl-2（1∶3000）、Caspase-3（1∶1000）和βactin（1∶5000）室溫孵育90 min，磷酸緩沖液清洗。辣根過氧化酶羊抗鼠IgG（1∶5000）和辣根過氧化酶羊抗兔IgG（1∶6000）室溫孵育60 min。 清洗后加電化學發光顯色液顯色。 Quantity One 軟件分析各條帶的吸光度值。

2.4 CCK-8 分析細胞活性

取在96 孔板中培養好的細胞，去除含藥培養基每孔加入100 μL 含有CCK-8 的培養基。 其中，以10 μL/孔的量，提前用完全培養基配制含CCK-8 的培養基。繼續孵育4 h 后，采用Bio-Tek 酶標儀分析450 nm 下的吸光度值。

2.5 平板克隆鑒定細胞增殖能力

將各組培養好的細胞用0.25%胰酶消化液消化并制成細胞懸液，調整細胞密度約為1×105個/mL。每組各取200 個/mL 細胞接種于6 孔板，37 ℃、5%CO2的培養箱中，每3 d 換液1 次，培養約3 周。 將培養好的細胞用4%多聚甲醛固定30 min。 0.5%結晶紫染色5 min 后，用清水洗3 遍。 相機拍照后，用酶標儀測定550 nm 下的吸光度值。

2.6 流式細胞術分析細胞周期

取出培養好的細胞，加入低溫PBS 漂洗細胞并使細胞重懸。加入1.2 mL 預冷的乙醇后，4 ℃放置過夜。采用PBS 去除乙醇。在4 ℃避光環境下，150 μL碘化丙啶工作液染色30 min。 流式細胞儀測定各細胞周期的百分率。

2.7 含藥血清制備與分組

2.7.1 含藥血清制備 如前期研究所述[13]，制備含DXKK 血清。SD 雄性大鼠被隨機分為空白對照組和DXKK 處理組，每組5 只。 DXKK 組的大鼠以組方12 g/kg（按大鼠與人的體表面積換算公式[14]計算，相當70 kg 成人劑量的3 倍）進行灌胃給藥，持續1周。空白對照組的大鼠以生理鹽水進行灌胃，持續1周。經腹腔麻醉后，在無菌條件下對大鼠進行腹主動脈采血。 血液室溫靜置2 h 后，進行離心、滅活和除菌。 分裝后置于-20 ℃的冰箱中凍存。

2.7.2 細胞分組與處理 取對數期生長的細胞，隨機分組為：空白對照組、AH 刺激組、空白血清干預組（AH 刺激+空白血清）、含DXKK 血清干預組（AH刺激+含DXKK 血清）、含DXKK 血清干預+Axin1過表達組。細胞通過AH（50 μg/mL）、空白血清或含DXKK 血清干預48 h 后，再進行其他實驗檢測。 其中，血清（空白血清或含DXKK 血清）與口腔上皮細胞完全培養基按體積1∶9 的比例被配制成含10%含藥血清。含DXKK 血清干預+Axin1 過表達組的細胞在轉染Axin1 過表達質粒后進行AH 和DXKK 干預。 空白對照組不做任何處理。

2.8 EdU 細胞增殖活性分析

取對數期生長的細胞，加入提前制備好的50 μmol EdU 培養基，37 ℃孵育過夜。 棄培養基，PBS 清洗2次。采用50 μL 4%多聚甲醛固定細胞。Apollo 染色液和Hoechst 33342 染色液分別在室溫、避光條件下孵育30 min 染色后，PBS 清洗2 次。 采用顯微鏡觀察和拍照。

2.9 統計學分析

采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0.1 進行統計分析。 實驗結果以“±s”表示。 采用One-way ANOVA 和Two-way ANOVA 分析多組間的數據。以P<0.05 代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 篩選Axin1 的干擾靶點

與干擾對照組比較，Axin1 干擾-1 組、Axin1 干擾-2 組和Axin1 干擾-3 組Axin1 的基因表達水平均顯著降低（P<0.01）。其中，Axin1 干擾-2 組的抑制效果最明顯。因此，選擇Axin1 siRNA-2 進行后續實驗。 干擾對照組Axin1 的基因表達水平與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 詳見圖1。

圖1 Axin1 干擾靶點的篩選

3.2 調控Axin1 影響口腔上皮細胞增殖活性

與干擾對照組比較，Axin1 干擾組Axin1 mRNA的表達水平顯著下降（P<0.01）。與過表達對照組比較，Axin1 過表達組Axin1 mRNA 的表達水平顯著升高（P<0.01）。空白對照組、過表達對照組和干擾對照組間Axin1 mRNA 的表達水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。與干擾對照組比較，Axin1 干擾組細胞增殖活性顯著升高（P<0.01）。 與過表達對照組比較，Axin1過表達組細胞增殖活性顯著降低（P<0.01）。 詳見圖2。

圖2 調控Axin1 影響口腔上皮細胞增殖活性

3.3 Axin1 影響增殖、凋亡相關蛋白的表達

與干擾對照組比較，Axin1 干擾組Axin1、Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表達顯著降低（P<0.05 或P<0.01），β-catenin、PCNA、Bcl-2 蛋白表達顯著升高（P<0.01）。 與過表達對照組比較，Axin1 過表達組Axin1、Bax、cleaved Caspase-3 蛋 白 表 達 顯 著 升 高（P<0.01），β-catenin、PCNA、Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P<0.01）。 詳見圖3、表2。

表2 各組上皮細胞中凋亡相關蛋白的表達比較

圖3 Axin1 影響凋亡相關蛋白的表達

3.4 過表達Axin1 促進G1/S 期細胞周期阻滯

與過表達對照組比較，Axin1 過表達組處于G1期的細胞比例顯著降低（P<0.01），處于S 期的細胞比例顯著升高（P<0.01）。 詳見圖4。

圖4 過表達Axin1 影響口腔上皮細胞的周期調控

3.5 DXKK 調控Axin1 影響口腔上皮細胞增殖活性

與空白對照組比較，AH 刺激組Axin1 蛋白表達顯著升高（P<0.01），細胞增殖活性顯著降低（P<0.01）。 與空白血清干預組比較，含DXKK 血清干預組Axin1 蛋白表達顯著降低（P<0.01），細胞增殖活性顯著升高（P<0.01）。 與含DXKK 血清干預組比較，含DXKK血清干預+Axin1 過表達組Axin1 蛋白表達顯著升高（P<0.05）， 細胞增殖活性顯著降低 （P<0.05）。 詳見圖5。

圖5 DXKK 調控Axin1 影響口腔上皮細胞增殖活性

4 討論

Axin1 的表達與細胞的增殖、凋亡密切相關[15-16]。本研究發現，在沉默/過表達Axin1 后，口腔上皮細胞的增殖活性隨之發生改變。 蛋白水平上，增殖、凋亡相關指標（PCNA、Bax、Bcl-2 和Caspase-3）也同樣受到影響，表明Axin1 參與口腔上皮細胞增殖、凋亡的生物學過程。 類似的，Axin1 作為腫瘤抑制因子參與肝細胞癌的增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化[17]。靶向Axin1 可以調控細胞的增殖、凋亡水平，影響帕金森病的發展[18]。 在缺氧誘導的心肌細胞損傷模型中，miR-3574 可通過抑制Axin1 影響細胞凋亡水平[19]。這些與本研究的結論一致，Axin1 可影響細胞的增殖活性。在過表達Axin1 后，細胞發生G1/S 期阻滯。這與前期研究發現一致，過表達Axin1 可誘導G1/S期細胞周期停滯[20]。 Axin1，Axin 蛋白中的一種，作為β-catenin破壞復合物的中心支架，與破壞復合物的其他核心成分相互作用[21-22]。 經典的Wnt 信號通路參與并控制許多生物過程，包括細胞生長、增殖和分化[23-24]。 同樣，失調的Wnt 信號通路影響OSF 的發展[25]，促進口腔癌變[26]。 破壞復合物對細胞溶質βcatenin 的降解是Wnt 通路的關鍵調控步驟[21]。 其中，Axin1參與復合物的組裝。 本研究證實，Axin1 沉默/過表達后，β-catenin 的蛋白水平發生改變。 這進一步表明，Axin1 可以通過β-catenin 信號影響細胞的增殖能力。

本課題組前期研究表明，DXKK 在治療OSF 中具有明顯的緩解效果[8]。 由丹參、玄參、當歸、紅花、生地黃、白花蛇舌草、夏枯草、生黃芪、薄荷、白芍、茵陳和桔梗等天然藥物研制而成的DXKK，具有活血化瘀、扶正祛邪等功效[8]。 其中，丹參、當歸和紅花活血化瘀，生黃芪益氣扶正，生地黃和玄參養陰清熱，白花蛇舌草解毒散瘀，薄荷辛涼爽口、疏散風熱[27]。臨床研究表明，DXKK 可改善患者體內微循環、調整血液狀態[27]。 本研究發現，OSF 可以調節Axin1 的表達。 在AH 誘導的口腔上皮細胞損傷模型中，Axin1的表達增加。而在DXKK 含藥血清處理后，Axin1 的表達受到抑制，且伴隨細胞增殖活性的上調，這表明DXKK 通過調控Axin1，緩解AH 誘導的細胞損傷。過表達Axin1 后，DXKK 對口腔上皮損傷細胞的增殖促進作用受到影響，提示Axin1 介導DXKK 緩解AH 誘導的上皮細胞損傷。

綜上所述，Axin1 可能介導DXKK 緩解AH 誘導的口腔上皮細胞細胞損傷，這將為探究DXKK 治療OSF 的內在機制提供可靠的科學線索。