天馬顆粒對(duì)結(jié)腸直癌細(xì)胞中FLI-1 啟動(dòng)子甲基化影響

王華帥，武明勝，李一金，謝 彪，羅 敏，何永恒*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院肛腸科，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是世界上第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年全球新發(fā)癌癥病例總數(shù)為1810 萬(wàn)例，癌癥死亡人數(shù)為960 萬(wàn)人。其中，結(jié)直腸癌占總病例的6.1%，占總癌癥死亡人數(shù)的9.2%[2]。 我國(guó)《2019 年全國(guó)癌癥報(bào)告》指出，結(jié)直腸癌依然是我國(guó)主要的惡性腫瘤之一，僅次于肺癌和胃癌。 國(guó)內(nèi)外研究一致認(rèn)為，結(jié)腸癌會(huì)造成沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。 目前，認(rèn)為其發(fā)病涉及疾病、腸道菌群、遺傳、年齡和表觀遺傳等因素。現(xiàn)代臨床治療結(jié)直腸癌常采用手術(shù)、放化療等方法，術(shù)后患者仍然面臨著生存質(zhì)量低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、藥物抵抗等不良反應(yīng)，中醫(yī)藥治療結(jié)直腸癌具有抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高免疫力、減輕放化療不良反應(yīng)及延長(zhǎng)生存周期等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

何永恒教授結(jié)合化痞膏、黃芪益損湯、內(nèi)消瘰疬丸三方化裁而研制成天馬顆粒，具有“拔癌毒，消結(jié)腫，通經(jīng)絡(luò)，止疼痛”功效，具備“攻、解、化、散、托”法的科學(xué)內(nèi)涵。 經(jīng)過(guò)多年臨床運(yùn)用及實(shí)驗(yàn)研究[5-13]，天馬顆粒組方得到不斷優(yōu)化，現(xiàn)已獲得專(zhuān)利[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LI-1 在結(jié)直腸癌中是個(gè)抑癌基因，其表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化影響，去甲基化作用后可使其過(guò)表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[15]。DNA 甲基化主要由甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, DNMT）和S-腺苷甲硫氨酸催化。 而DNMT1、DNMT3a 是DNMT主要組成。 本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以HCT116、HT29、Caco-2 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察天馬顆粒血清對(duì)FLI-1 蛋白表達(dá)的影響， 探究對(duì)FLI-1 啟動(dòng)子甲基化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、Caco-2 細(xì)胞株購(gòu)自武漢procell 公司，批號(hào)CL-0096、CL-0118、CL-0050；8 周齡SD 雄性大鼠20 只，體質(zhì)量（200±20) g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證：430727201101275856，倫理編號(hào)：LLBH-202010130001。

1.2 主要藥物及試劑

天馬顆粒購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（批準(zhǔn)號(hào)[湘]衛(wèi)藥劑9706024），規(guī)格10×10 g/包，用法：成人1 包/次，2 次/d。將上述藥物加水加熱30 min，使藥物溶解，過(guò)濾；在殘?jiān)欣^續(xù)加水加熱30 min，過(guò)濾，重復(fù)操作，使得藥物充分溶解，合并濾液，混合濃縮制備成含藥質(zhì)量濃度為0.09 g/mL 的藥液，滅菌后置于4 ℃冰箱保存。

DNMT1、DNMT3a 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab113470、ab113469）；FLI-1 抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)：A5644）；actin 抗體（美國(guó)proteintech 公司，批號(hào)：66009-1-Ig）；mRNA逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker（中國(guó)北京康為世紀(jì)公司，批號(hào)：CW2569、CW2141、CW2601、CW0632）；DEPC、Tris（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：D5758-25ML、V900483）；Trizol（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)15596026）；核酸染料（中國(guó)北京普利萊公司，批號(hào)：PB11141）；BCA 蛋白試劑盒（長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司，批號(hào)：CW0014S）。

1.3 主要儀器

臺(tái)式冷凍離心機(jī)(中國(guó)湖南湘儀公司，型號(hào)：H1650R)；熒光PCR 板、熒光定量RCP 儀(美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)：PIKOREAL96、SPL0960)；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽（中國(guó)北京六一公司，型號(hào)：DYY-2C、DYCP-31DN）；旋渦混合器（中國(guó)江蘇其林貝爾公司，型號(hào)：GL-88B）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812、MB-530）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116、HT29 細(xì) 胞 株 采 用McCoy′s 5A+1%青-鏈霉素雙抗培養(yǎng)基，Caco-2 細(xì)胞采用MEM 培養(yǎng)基+1%青-鏈霉素雙抗培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 動(dòng)物血清制備

將20 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為2 組，中藥組和空白組，每組10 只。 中藥組按照人-動(dòng)物體表面積關(guān)系換算出大鼠每日中藥等效劑量1.86 g/kg，給予相應(yīng)中藥藥液灌胃，2 次/d；空白組予以等容量的滅菌水灌胃。 連續(xù)給藥7 d，末次灌胃1 h 后，采用腹主動(dòng)脈采血法，離心、提取血清、過(guò)濾、滅活補(bǔ)體，保存在-20 ℃的冰箱中備用。

1.6 分組

將每種結(jié)直腸癌細(xì)胞分為3 組：Blank 組、NC組、TMKL 組，Blank 組為空白對(duì)照，NC 組予以空白血清干預(yù)，TMKL 組予以天馬顆粒血清干預(yù)。

1.7 CCK8 篩選天馬顆粒血清最佳干預(yù)濃度

以5×103/mL 細(xì)胞密度接種至96 孔培養(yǎng)板中，用冷培養(yǎng)液將細(xì)胞同步化處理后，分別加入胎牛血清、空白血清和天馬顆粒血清，每組設(shè)置5%、10%、15%、20%，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。待分別干預(yù)處理24 h后，吸棄上清，每孔加入10 μL CCK8 溶液及90 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育2 h。 使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處OD 值。 細(xì)胞增殖率=[（對(duì)照孔OD 值-實(shí)驗(yàn)孔OD 值）/對(duì)照孔OD 值]×100%。

1.8 Western blot 檢測(cè)FLI-1 蛋白相對(duì)表達(dá)

將分組處理過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，4500 r/min離心5 min，離心半徑17.8 cm，去上清液，加入裂解液，冰上裂解30 min，配制BSA 濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液及BCA 工作液，在進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析后，進(jìn)行蛋白電泳，電泳條件為90 V，30 min 后轉(zhuǎn)120 V，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后在4 ℃條件下孵育一抗FLI-1(1∶1000)和內(nèi)參β-actin(1∶5000)孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，采用化學(xué)發(fā)光劑顯影，Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 qPCR 檢測(cè)FLI-1 mRNA 表達(dá)

使用Trizol 法提取各組細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定RNA 濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)。 運(yùn)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列

1.10 ELISA 檢測(cè)DNMT1、DNMT3a 蛋白

根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)分組處理后的細(xì)胞進(jìn)行DNMT1、DNMT3a 蛋白含量檢測(cè)。

1.11 MSP 檢測(cè)FLI-1 啟動(dòng)子甲基化

根據(jù)基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取各組細(xì)胞中基因組DNA，應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度，采用EZ DNA 甲基化試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鈉處理，利用反應(yīng)柱進(jìn)行脫硫及凈化，純化后DNA 可用于后續(xù)PCR 反應(yīng)。 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性45 s、58 ℃(甲基化)/57 ℃(非甲基化) 45 s、72 ℃退火45 s，35 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。 FLI-1 啟動(dòng)子甲基化引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 FLI-1 啟動(dòng)子甲基化引物設(shè)計(jì)

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 7.2 繪圖。 計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov法檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布的采用“±s”表示，行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位間距）描述，行Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 天馬顆粒血清最佳干預(yù)濃度

同Blank 組、NC 組相比，TMKL 組含藥血清為20%時(shí)，HCT116、HT29 和Caco-2 細(xì)胞增殖均受到抑制（P<0.05）。因此，選取20%的天馬顆粒血清濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度天馬顆粒血清對(duì)多種結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 天馬顆粒血清對(duì)FLI-1 蛋白相對(duì)表達(dá)及mRNA 表達(dá)影響

在HCT116 細(xì)胞、Caco-2 細(xì)胞中，同Blank 組、NC組相比，TMKL 組FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)升高（P<0.05）；同NC 組相比，Blank 組FLI-1 蛋白及mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 在HT29 細(xì)胞中，同Blank 組、NC 相比，TMKL 組FLI-1 蛋白及mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；同NC 組相比，Blank組FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 天馬顆粒血清對(duì)多種結(jié)直腸癌細(xì)胞FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)影響

2.3 天馬顆粒血清對(duì)DNMT1、DNMT3a 蛋白表達(dá)影響

在HCT116、HT29 和Caco-2 細(xì)胞中，同Blank組、NC 組相比，TMKL 組DNMT1、DNMT3a 的表達(dá)量下降（P<0.05）；同NC 組相比，Blank 組DNMT1、DNMT3a 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)圖3。

圖3 天馬顆粒血清對(duì)多種結(jié)直腸癌細(xì)胞DNMT1、DNMT3a 蛋白表達(dá)影響

2.4 天馬顆粒血清對(duì)FLI-1 啟動(dòng)子甲基化影響

在HCT116 細(xì)胞中，同Blank 組、NC 相比，TMKL組細(xì)胞FLI-1 啟動(dòng)子產(chǎn)生了部分去甲基化，甲基化減弱，非甲基化增多；NC 組同Blank 相比無(wú)變化。在HT29 細(xì)胞中，Blank 組、NC 組和TMKL 組細(xì)胞FLI-1啟動(dòng)子無(wú)甲基化；在Caco-2 細(xì)胞中，同Blank 組、NC 組相比，TMKL 組細(xì)胞FLI-1 啟動(dòng)子完全去甲基化，NC 組同Blank 組相比無(wú)變化。 詳見(jiàn)圖4。

圖4 天馬顆粒血清對(duì)多種結(jié)直腸癌細(xì)胞FLI-1 啟動(dòng)子甲基化影響

3 討論

DNA 甲基化異常是表觀遺傳學(xué)改變的一個(gè)常見(jiàn)形式，并已被證明與多種癌癥密切相關(guān)[16-17]。 常見(jiàn)的DNA 甲基化包括啟動(dòng)子CpG 島的局灶性高甲基化和DNA 的整體低甲基化。 前者會(huì)觸發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默，而后者會(huì)降低染色體的穩(wěn)定性，這是癌癥發(fā)展過(guò)程中最關(guān)鍵的表觀遺傳學(xué)改變。DNA 甲基化主要由DNMT 和S-腺苷甲硫氨酸催化。這種變化通常是可逆的。而DNMT1、DNMT3a 是DNMTs 主要組成。DNMT1 主要參與新合成的單鏈DNA 甲基化，并將甲基化信息傳遞給后代細(xì)胞，在DNA 復(fù)制中維持甲基化發(fā)揮主要作用。 DNMT3a 主要負(fù)責(zé)在胚胎發(fā)生過(guò)程中DNA 甲基化[18]。腫瘤細(xì)胞中DNMT 的高表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因的高甲基化，進(jìn)而失活，最終導(dǎo)致腫瘤的形成[19-20]。 MSP 是目前較為常用的甲基化檢測(cè)方法，MSP 條帶亮度在一定程度上可代表發(fā)生甲基化的基因啟動(dòng)子含量，即反映基因的甲基化水平[21]。

傳統(tǒng)中藥及一些提取物具有去甲基化作用，相對(duì)于化學(xué)合成藥物，其對(duì)正常組織損傷低，副作用小[22]。王劍等[23]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎健骨中藥復(fù)方通過(guò)降低骨組織Leptin 啟動(dòng)子甲基化防治骨質(zhì)疏松癥，任玲[24]運(yùn)用簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)通脈逐瘀顆粒對(duì)冠心病氣滯血瘀證的可能機(jī)制是降低APOA5基因甲基化水平。陳馨等[25]使用高濃度的姜黃素干預(yù)胃癌SGC-7901 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞具有抑制增殖作用，且對(duì)p16 和MGMT 基因具有甲基化抑制作用，并促進(jìn)基因表達(dá)。

在天馬顆粒血清干預(yù)后，HCT116、HT29 和Caco-2 細(xì)胞的DNMT1、DNMT3a 表達(dá)降低（P<0.05），HCT116 細(xì)胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)升高（P<0.05），HT29 細(xì)胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)無(wú)顯著變化（P<0.05），Caco-2 細(xì)胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)升高（P<0.05）。

此外，MSP 中Blank 組結(jié)果顯示，HCT116 細(xì)胞中FLI-1 啟動(dòng)子部分甲基化，HT29 細(xì)胞中FLI-1 啟動(dòng)子無(wú)甲基化，Caco-2 細(xì)胞中FLI-1 啟動(dòng)子完全甲基化。MSP 中TMKL 組結(jié)果顯示，對(duì)于存在FLI-1 甲基化的HCT116 細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞，天馬顆粒可以促使FLI-1 去甲基化；而對(duì)不存在FLI-1 啟動(dòng)子甲基化的HT29 細(xì)胞，天馬顆粒對(duì)FLI-1 甲基化無(wú)影響。

前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LI-1 基因的表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控[15]，DNMT1 及DNMT3a 是維持DNA 甲基化酶，而天馬顆粒血清抑制DNMT1 及DNMT3a 表達(dá)。 結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)天馬顆粒可能通過(guò)抑制DNMT1 及DNMT3a 表達(dá)，使得FLI-1 甲基化減弱，從而上調(diào)FLI-1 蛋白及mRNA 表達(dá)。

綜上所述，天馬顆粒血清可能是通過(guò)抑制DNMT1、DNMT3a 蛋白表達(dá)，促使結(jié)直腸癌細(xì)胞中FLI-1 啟動(dòng)子去甲基化，進(jìn)而上調(diào)其表達(dá)。