基于藥效及正交試驗研究藍金口服液提取純化工藝

宋 軍，陳 靜，劉學武，鄒振興，宋太發(fā)，徐康平，周書奧，譚桂山，王毅清，張樂佳*

（1.湖南中嘉生物醫(yī)藥有限公司，湖南 長沙 410036；2.新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410331；3.中南大學湘雅藥學院，湖南 長沙 410013）

藍金口服液作為醫(yī)院制劑用于臨床20 余年，治療風熱表證型上呼吸道感染療效確切。 方中板藍根清解疫毒為君，配金銀花、連翹為臣，可清熱解毒，增板藍根之效；用柴胡、荊芥為佐，開肌腠以祛邪外出，透疫毒以泄邪熱。 各藥相合，于清熱解毒之中透表泄熱，發(fā)汗祛邪之中解毒消腫，對溫疫邪毒侵犯人體，發(fā)熱較甚，邪在衛(wèi)表者，常為對證之劑。

中藥制劑提取純化工藝的篩選主要通過正交試驗優(yōu)選其工藝條件，評價指標多偏重指標成分，而指標成分的含量高低與臨床療效并沒有直接聯(lián)系，通過指標成分的含量高低來評價工藝優(yōu)劣有失偏頗[1-2]。中藥新藥研究中鼓勵以“療效指標”來評價工藝優(yōu)劣，包括有效成分含量、藥物效應的高低等。 本研究采用中藥藥理和中藥化學相結合的中藥研究思路，針對處方的功能主治，結合處方藥味活性成分的性質(zhì)，設計不同的提取純化工藝，選擇大鼠干酵母所致體溫升高模型進行藥效學研究[3]，以樣品藥物效應強度為評價指標，選取合適的提取純化工藝。在此基礎上，通過正交試驗和單因素考察試驗，進一步優(yōu)化提取純化工藝，為后續(xù)新藥研發(fā)提供基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，型號：1260）；數(shù)顯恒溫水浴鍋、電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司，型號：DK-98-Ⅱ、WGL-125B）；超純水機（密理博有限公司，型號：Direct-Q5UV-R）；高速離心機（長沙英泰儀器有限公司，型號：TG16）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，型號：SECURA225D-1CN）。

1.2 主要藥品

腺苷對照品（批號：110879-201703，純度：99.7%）、綠原酸對照品（批號：110753-202018，純度：96.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；活性干酵母粉（安琪酵母股份有限公司，批號：12000222）；阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健公司，批號：BJ32600）；甲醇和乙腈（色譜純，美國TEDIA 公司），其他試劑均為分析純。板藍根[4]214-215（批號：210401）、金銀花[4]230-232（批號：210301）、連翹[4]177-178（批號：210102）、柴胡[4]293（批號：201201）、荊芥[4]243-244（批號：201201）、射干[4]297-298（批號：210401）、甘草[4]88-89（批號：210106）等藥材飲片均購自湖南新匯制藥股份有限公司，經(jīng)鑒定與分析，均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版一部[4]各藥味項下規(guī)定。

1.3 實驗動物

健康SD 大鼠110 只，雌雄各半，普通級，體質(zhì)量（200±20） g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。于湖南省藥物安全評價研究中心實驗室飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0015。 動物飼養(yǎng)溫度：20～26 ℃，濕度：40%～70%，換氣次數(shù)≥15 次/h，照明時間：每日12 h/12 h 交替照明。

2 方法

2.1 基于藥效試驗的工藝初篩

2.1.1 實驗藥物制備 （1）GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-05 樣品的制備。 取處方量藥材荊芥，加10 倍量水，蒸餾法提取約400 mL 芳香水，備用；藥渣中加入處方量其他藥材金銀花、連翹、柴胡、板藍根、射干、甘草，補加水至總藥材的10 倍量，加熱提取2 h，濾過；第2 次加10 倍量水提取1.5 h，濾過，合并濾液，取4 份濾液，每份為總體積的1/5，濃縮至相對密度為1.05～1.10 的清膏（60 ℃測），離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），分別加乙醇至醇濃度為0%、30%、50%、70%，醇沉，離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），取上清液，濃縮至無醇味，加入相當量芳香水，加水調(diào)整體積至200 mL；得GY-01、GY-02、GY-03、GY-04 樣品。 上述藥渣加10 倍量70%乙醇提取1.5 h，濃縮至無醇味，加水定容過濾，得GY-05 樣品。

（2）GY-06、GY-07、GY-08、GY-09 樣 品 的 制備。 取處方量藥材金銀花、連翹、柴胡、荊芥，加10倍量水，蒸餾法提取約400 mL 芳香水，備用；藥渣中加入處方量其他藥材（板藍根、射干、甘草），補加水至總藥材的10 倍量，加熱提取2 h，濾過；第2 次加8 倍量水提取1.5 h，過濾，合并濾液，取4 份濾液，每份為總體積的1/5，濃縮至相對密度1.05～1.10的清膏（60 ℃測），離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），分別加醇至醇濃度為0%、30%、50%、70%，醇 沉，離 心（2500 r/min，20 min，離 心 半 徑9.954 cm），取上清液，濃縮至無醇味，加入相當量芳香水，加水調(diào)整體積至200 mL；得GY-06、GY-07、GY-08、GY-09 樣品。

2.1.2 藥效篩選試驗 （1）分組、給藥。 試驗大鼠于檢疫結束后測肛溫2 次，選取體溫波動小于0.5 ℃的健康SD 大鼠110 只，雌雄各半，體質(zhì)量180.1～219.4 g，按性別、體質(zhì)量隨機分為5 組，每組10 只，分別為模型組、阿司匹林組（5.4 mL/kg）及GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-05、GY-06、GY-07、GY-08、GY-09 樣品組。 每日給藥前將阿司匹林片（研磨成粉末）及GY 樣品用蒸餾水按劑量配制成相應濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。各給藥組大鼠按10 mL/kg 灌胃給予相應濃度藥液，1 次/d，連續(xù)7 d，模型對照組灌胃給予等體積蒸餾水。

（2）指標檢測。 各組大鼠于給藥第5、第6 天分別測定肛溫1 次，使之適應。 于末次給藥前禁食不禁水12 h，造模前測定基礎肛溫值，測定后各鼠背部皮下注射20%干酵母-生理鹽水懸液10 mL/kg，于造模后4 h 按組別灌胃給予對應藥物或蒸餾水，檢測造模后1、2、4、5、6、8、10 h 肛溫，并計算體溫波動值△t=t基礎體溫-t造模后體溫。

（3）試驗結果。 各組大鼠造模前體溫無明顯差異。 與模型組比較，GY-07 組大鼠造模后5 h 體溫波動值顯著減?。≒<0.05）；阿司匹林組及GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-06、GY-07、GY-08、GY-09 組大鼠造模后6 h 體溫波動值顯著減小（P<0.05 或P<0.01）；阿司匹林組及GY-01、GY-02、GY-06、GY-07、GY-08 組大鼠造模后8 h 及10 h 體溫波動值顯著減?。≒<0.05 或P<0.01）。 詳見表1。

表1 各組大鼠體溫波動值比較（±s，n=10，℃）

表1 各組大鼠體溫波動值比較（±s，n=10，℃）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h 造模后8 h 造模后10 h模型組阿司匹林組GY-01 組GY-02 組GY-03 組GY-04 組GY-05 組GY-06 組GY-07 組GY-08 組GY-09 組37.1±0.3 37.1±0.3 37.1±0.3 37.2±0.3 37.1±0.3 37.0±0.3 37.1±0.3 37.0±0.3 37.2±0.4 37.1±0.2 37.1±0.2-0.7±0.6-0.6±0.4-0.7±0.2-0.6±0.3-0.6±0.4-0.5±0.4-0.6±0.6-0.5±0.4-0.7±0.4-0.6±0.2-0.6±0.5-0.5±0.2-0.6±0.4-0.5±0.3-0.5±0.3-0.6±0.5-0.5±0.3-0.5±0.5-0.4±0.4-0.3±0.4-0.4±0.3-0.3±0.3 0.1±0.5 0.1±0.5 0.1±0.3 0.0±0.4 0.0±0.5 0.1±0.3 0.1±0.4 0.1±0.4 0.1±0.4 0.1±0.4 0.0±0.4 0.7±0.4 0.6±0.2 0.6±0.3 0.5±0.5 0.5±0.3 0.5±0.4 0.8±0.4 0.7±0.4 0.3±0.5*0.5±0.3 0.5±0.4 1.8±0.4 0.9±0.4**0.9±0.2**1.0±0.4**1.2±0.4**1.4±0.4*1.7±0.5 0.9±0.3**0.7±0.4**1.2±0.3**1.2±0.6**1.7±0.4 0.8±0.4**1.0±0.4**1.0±0.2**1.5±0.3 1.5±0.4 1.6±0.6 1.0±0.3**0.7±0.4**1.1±0.5**1.5±0.4 1.7±0.6 0.8±0.3**1.1±0.2**1.1±0.4**1.4±0.5 1.5±0.5 1.7±0.5 1.1±0.4**0.8±0.1**1.3±0.3*1.5±0.5

結果顯示，GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-06、GY-07、GY-08、GY-09 樣品均能顯著降低干酵母所致大鼠體溫，其中GY-07 樣品起效時間最早，體溫波動值最小，效果最優(yōu)。

鑒于上述試驗結果，可確認GY-07 樣品的制備工藝為初步提取純化工藝：取處方量金銀花、連翹、柴胡、荊芥，加10 倍量水，蒸餾法提取約400 mL 芳香水，備用；在上述藥渣中加入處方量板藍根、射干、甘草，補加水至總藥材的10 倍量，加熱提取2 h，濾過；第2 次加8 倍量提取1.5 h，過濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度1.05～1.10 的清膏（60 ℃測），離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），上清液加乙醇至醇濃度為30%，醇沉純化。 考慮在此基礎上，通過正交試驗進一步優(yōu)選藍金口服液的最佳提取工藝。

2.2 腺苷、綠原酸的含量測定

2.2.1 腺苷的含量測定[5-6]（1）色譜條件。 COSMOSIL 親水柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（10∶90）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量:10 μL；理論板數(shù)按腺苷峰計算應不低于5000。

（2）對照品溶液的制備。 精密稱取腺苷對照品16.78 mg，置100 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（3）供試品溶液的制備。按藥效試驗篩選的初步提取工藝制備提取液，搖勻，量取約8 mL 置于離心管中，以3000 r/min 離心15 min（離心半徑10.58 cm），取上清液，即得。

（4）陰性樣品溶液的制備。 按處方量稱取除板藍根外的6 味藥材，按藥效試驗篩選的初步提取工藝制備缺板藍根的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

（5）專屬性試驗。 分別取對照品溶液、供試品溶液、缺板藍根的陰性樣品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件測定，結果如圖1 所示。 陰性樣品色譜圖中，在與腺苷對照品相同保留時間處未見色譜峰，表明陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 藍金口服液腺苷專屬性試驗色譜圖

（6）線性關系考察。 分別精密吸取“2.2.1（2）”制備的對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋成不同系列標準溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量為X 軸，峰面積為Y 軸，進行線性回歸分析，得回歸方程：Y=276.13X+10.9，R2=1.000 0。 結果表明，腺苷的質(zhì)量在0.083 7～1.673 0 mg 的范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量呈現(xiàn)良好的線性關系。

（7）精密度試驗。 取按“2.2.1（2）”項下方法制備的對照品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次。測定腺苷峰面積，結果得峰面積RSD 為0.78%，表明儀器精密度良好。

（8）穩(wěn)定性試驗。 取按“2.2.1（3）”項下方法制備的供試品溶液，按“2.2.1（1）”項下色譜條件，分別于0、4、8、12、24、48 h 注入液相色譜儀，結果得峰面積RSD 為0.60%，表明供試品溶液放置48 h 內(nèi)，溶液基本穩(wěn)定。

（9）重復性試驗。 取按“2.2.1（3）”項下方法制備的供試品溶液6 份，按“2.2.1（1）”項下色譜條件測定腺苷含量，結果得RSD 值為0.57%，表明方法重復性良好。

（10）加樣回收率試驗。稱取腺苷對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，得約0.175 mg/mL 腺苷對照品溶液。 精密量取已測腺苷含量的供試品溶液5 mL 于10 mL 量瓶中，再分別精密量取上述腺苷對照品溶液1、2、2.4 mL（回收率50% S1、回收率100% S2、回收率120% S3），混合，搖勻，加流動相定容至刻度。量取約8 mL 置于離心管中，以3000 r/min 離心15 min（離心半徑10.58 cm），取上清液，即得。 每種濃度分別制備3 份供試品溶液，用9 份樣品的測定結果進行評價，結果見表2?？芍佘掌骄厥章蕿?4.58%，RSD 為2.64%，表明該法的回收率良好。

表2 腺苷加樣回收率試驗結果（n=9）

2.2.2 綠原酸的含量測定[4]230-232（1）色譜條件。 Agilent Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸（10∶90）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；進樣量:10 μL；理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于5000。

（2）對照品溶液的制備。精密稱取綠原酸對照品10.73 mg，置100 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（3）供試品溶液的制備。按藥效試驗篩選的初步提取工藝制備提取液，搖勻，量取約8 mL 置于離心管中，以3000 r/min 離心15 min（離心半徑10.58 cm），取上清液，即得。

（4）陰性樣品溶液的制備。按處方量稱取除金銀花外的6 味藥材，按藥效試驗篩選的初步提取工藝制備缺金銀花的陰性樣品，按“2.2.2（3）”供試品溶液的制備方法制備，即得。

（5）專屬性試驗。 分別取對照品溶液、供試品溶液、缺金銀花的陰性樣品溶液，按“2.2.2（1）”項下色譜條件測定，結果如圖2 所示。 陰性樣品色譜圖中，在與綠原酸對照品相同保留時間處未見色譜峰，表明陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖2 藍金口服液綠原酸專屬性試驗色譜圖

（6）線性關系考察。 分別精密吸取“2.2.2（2）”制備的對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋成不同系列標準溶液，按“2.2.2（1）”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量為X 軸，峰面積為Y 軸，進行線性回歸分析，得回歸方程為：Y=2 812.8X+6.356 2，R2=0.999 9。 結果表明綠原酸的質(zhì)量在0.051 6～1.031 0 mg 的范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量呈現(xiàn)良好的線性關系。

（7）精密度試驗。 取按“2.2.2（2）”項下方法制備的對照品溶液連續(xù)進樣6 次。 測定綠原酸峰面積，結果得峰面積RSD 為0.16%，表明儀器精密度良好。

（8）穩(wěn)定性試驗。 取按“2.2.2（3）”項下方法制備的供試品溶液6 份，按“2.2.2（1）”項下色譜條件，分別于0、4、8、12、24、48 h 注入液相色譜儀，結果得峰面積RSD 為0.54%， 表明供試品溶液放置48 h 內(nèi)，溶液基本穩(wěn)定。

（9）重復性試驗。 取按“2.2.2（3）”項下方法制備的供試品溶液6 份，按“2.2.2（1）”項下色譜條件測定綠原酸含量，結果得RSD 值為1.71%，表明方法重復性良好。

（10）加樣回收率試驗。稱取綠原酸對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，得約2 mg/mL 綠原酸對照品溶液。 精密量取已測綠原酸含量的供試品溶液5 mL 于10 mL 量瓶中，再分別精密量取上述綠原酸對照品溶液1、2、2.4 mL（回收率50% S1、回收率100% S2、回收率120% S3），混合，搖勻，加流動相定容至刻度。 量取約8 mL 置于離心管中，以3000 r/min離心15 min（離心半徑10.58 cm），取上清液，即得。 每種濃度分別制備3 份供試品溶液進行測定，用9 份樣品的測定結果進行評價，結果見表3。 可知，綠原酸平均回收率為102.37%，RSD為1.88%，表明該法的回收率良好。

表3 綠原酸加樣回收率試驗結果（n=9）

2.3 提取工藝考察

君藥板藍根水煎劑具有抗細菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，在體外能抑制多種細菌生長，其代表性成分為腺苷，有抗炎、抗菌、抗病毒作用[7-9]；臣藥金銀花含綠原酸、異綠原酸等，其煎劑對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀菌屬、霍亂弧菌、傷寒沙門菌等致病菌有一定的抑制作用，對肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、結核分枝桿菌亦有效[10-12]。 因此，測定綠原酸、腺苷的提取量和浸膏得率[浸膏得率=干膏質(zhì)量×稀釋倍數(shù)/藥材質(zhì)量×100%]能反映和控制該提取液的內(nèi)在質(zhì)量，可以作為提取工藝的評價指標。

正交試驗及結果，根據(jù)藥效試驗確定的初步提取工藝，選取藥材浸泡時間（A）、料液比（B）、提取時間（C）、空白（D）為試驗因素，每個因素選取3 個水平，設計正交試驗（見表4），優(yōu)選最佳提取工藝。 先將處方量比例的荊芥、金銀花、柴胡、連翹提取芳香水，藥渣和其他處方量比例的板藍根、射干、甘草3味藥材共同進行提取。以提取液浸膏得率、綠原酸及腺苷提取量為評價指標，采用綜合評分法進行數(shù)據(jù)處理[13]，權重系數(shù)浸膏得率為0.4，腺苷提取量和綠原酸提取量均為0.3。 正交試驗結果見表5，方差分析見表6。

表6 提取工藝方差分析表

綜合評分=（浸膏得率/浸膏得率最大值）×0.4+（腺苷提取量/腺苷提取量最大值）×0.3+（綠原酸提取量/綠原酸提取量最大值）×0.3。

由表5-6 可知，綜合評分的影響大小順序為B>C>A，其中B 對提取結果有顯著性影響（P＜0.05），綜合直觀分析和方差分析結果，A2B2C2組合為最優(yōu)提取工藝；但C 因素影響無顯著性（P＞0.05），從大生產(chǎn)中節(jié)能考慮，C 因素選擇C3，以A2B2C3組合為宜，即藥材加水浸泡30 min 后，提取2 次，第1 次加10 倍量水提取1.5 h，第2 次加8 倍量水提取1.0 h。 另外，A2B2C3組合為正交實驗實施例之一，其試驗結果表明，該組合的評價指標浸膏得率、腺苷提取量和綠原酸提取量均為正交實驗實施例中最優(yōu)，故不考慮最佳提取工藝驗證試驗。

表5 正交試驗表及結果

2.4 醇沉工藝考察

藥效試驗研究中發(fā)現(xiàn)，藥液經(jīng)低濃度醇沉（30%），活性沒有減弱，且醇沉有部分沉淀析出。 因此，擬對提取液進行醇沉工藝考察，同時，需要綜合考察醇沉工藝對后續(xù)口服液稀配、冷藏、過濾等工藝的影響。本研究考慮以醇沉液沉降、過濾情況，沉淀質(zhì)量，制劑澄清度及綠原酸，腺苷轉移率為評價指標，采用單因素考察方法，優(yōu)選最佳醇沉濃度、醇沉時間，以獲得最佳醇沉工藝。

2.4.1 醇沉樣品制備 按最佳提取工藝制備提取液，減壓濃縮至相對密度1.05～1.10 的清膏（60 ℃測），離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），取上清液300 mL，均分成3 份，分別加入乙醇至醇濃度為20%、30%、40%，攪拌均勻，靜置冷藏（5～10 ℃），即得。

2.4.2 醇沉試驗結果 于3、6、12 h 分別觀察并記錄各醇沉濃度溶液沉降情況，12 h 后取出，離心出沉淀，并干燥、稱重。 離心液回收乙醇至無醇味，分別加入蔗糖25 g 使溶解，加入100 mL 芳香水，加水調(diào)整體積至250 mL，0.8 μm 微孔濾膜過濾，觀察過濾效果，濾液置冰箱中冷藏48 h（5～10 ℃），觀察澄清情況。 詳見表7。

同時，取上清液按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法測定腺苷和綠原酸含量，測定醇沉12 h 和稀配后冷藏48 h 溶液中腺苷和綠原酸含量，計算醇沉工藝過程中腺苷和綠原酸的轉移率。 詳見表7。

表7 醇沉濃度考察結果

結果顯示，不同濃度乙醇在醇沉工藝中腺苷和綠原酸轉移率差別不大，但樣品經(jīng)30%、40%醇沉能除掉部分大極性雜質(zhì)，有助制劑澄清，30%、40%醇沉12 h，均可保證后續(xù)制劑的澄清；但從大生產(chǎn)中節(jié)能考慮，結合藥效篩選結果，藥液經(jīng)30%醇沉活性最強；優(yōu)選出醇沉工藝為醇沉前藥液的相對密度為1.05～1.10（60 ℃測），離心（2500 r/min，20 min，離心半徑9.954 cm），取上清液加入乙醇至醇濃度為30%，醇沉12 h。

2.5 工藝驗證試驗

根據(jù)藍金口服液處方量稱取各味藥材共計3份，采用優(yōu)選的最佳提取純化工藝條件制備3 批藍金口服液樣品，測定浸膏得率[浸膏得率=干膏質(zhì)量×稀釋倍數(shù)/藥材質(zhì)量×100%]，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法測定腺苷和綠原酸含量，并計算得到綠原酸及腺苷提取量，結果見表8。3 批樣品所得浸膏得率、綠原酸及腺苷提取量RSD 值較小，表明該提取純化工藝穩(wěn)定可行。

表8 工藝驗證試驗結果

3 討論

開發(fā)高效、安全的中藥復方制劑已經(jīng)成為藥學研究者們關注的重點。其中，中藥復方制劑提取純化工藝研究尤為重要，中藥有效成分的提取純化效率往往受到多種因素的影響，使得對提取純化效果的評估較為困難，因此，運用科學的評價方法對中藥有效成分的提取純化工藝進行研究顯得尤為關鍵。

藍金口服液作為治療風熱表證型上呼吸道感染的中藥復方制劑，處方中荊芥的揮發(fā)油類成分具有明顯的抗炎、抗病毒活性[14-15]，與其他適合水煎藥材一起水煎易造成揮發(fā)油成分損失，因此，進行水煎之前需對荊芥揮發(fā)油先行水蒸氣蒸餾提取。同時，處方中金銀花、連翹、柴胡中也含有揮發(fā)油類成分，均為抗炎、抗病毒活性成分[16-18]，也需考慮進行揮發(fā)油成分的水蒸氣蒸餾提取。 因此，擬設計兩種工藝條件：（1）荊芥單獨提取揮發(fā)油；（2）荊芥、金銀花、連翹、柴胡合并提取揮發(fā)油；再與其余諸藥一起水提，并考慮提取藥液的醇沉。

本研究采用干酵母致熱大鼠模型對上述兩種工藝進行了藥效篩選，最終確定第2 種工藝所得樣品的藥物效應強度最優(yōu)。 在藥效篩選試驗確定的提取工藝基礎上，設計以腺苷、綠原酸的提取量和浸膏得率為評價指標，采用綜合評分法進行數(shù)據(jù)處理，通過正交試驗進一步優(yōu)選藍金口服液的最佳提取工藝。 基于藥效篩選工藝確定提取次數(shù)為2 次，故選擇浸泡時間、料液比、提取時間作為正交試驗的考察因素。

醇沉工藝研究中，在藥效篩選試驗確定的純化工藝基礎上，以醇沉液沉降、過濾情況，沉淀質(zhì)量，制劑澄清度及綠原酸，腺苷轉移率為評價指標，采用單因素考察方法，進一步優(yōu)選最佳醇沉工藝，同時綜合考察了醇沉工藝對后續(xù)口服液稀配、冷藏、過濾等工藝的影響。 在后續(xù)的研究中，應補充考察醇沉溫度、攪拌速度等因素對醇沉工藝的影響。

藍金口服液處方中板藍根為君藥，應首選其有效成分作為工藝研究評價指標，《中華人民共和國藥典》2020 年版一部板藍根[4]214-215質(zhì)量標準項下的含量測定指標為（R,S）-告依春，本實驗發(fā)現(xiàn)，其水溶性差，很難轉移到口服液中，不適合作為口服液的工藝評價指標。 現(xiàn)有研究表明，板藍根的主要有效成分之一腺苷，具有抗炎、抗病毒作用，且具有較好的水溶性，能較好地轉移到口服液中，故選取其作為工藝研究評價指標[19-20]。 金銀花為臣藥，《中華人民共和國藥典》2020 年版一部金銀花[4]230-232質(zhì)量標準項下的含量測定指標之一為綠原酸，是其抗菌、抗病毒作用的主要有效成分，其具有較好的水溶性，能較好地轉移到口服液中，故選取其作為另一工藝評價指標。上述評價指標結合浸膏得率，能較為全面地反映和控制提取液的內(nèi)在質(zhì)量。

本研究基于中藥藥理和中藥化學相結合的中藥研究思路，進行了提取純化工藝條件的選擇，避免僅以化學成分為評價指標造成的提取純化工藝研究的片面性和局限性。 此工藝可行、穩(wěn)定，為藍金口服液的后續(xù)開發(fā)提供了可靠的實驗依據(jù)。