原位雜交技術檢測組織切片中MicroRNA的應用進展

丁成龍 劉瀅 劉爽(佳木斯大學 附屬第一醫院病理科,黑龍江 佳木斯 5400; 臨床醫學院; 基礎醫學院)

微小核糖核酸(microRNA) 又稱miRNA 或miR,是目前研究最為深入的一類非編碼RNA。至今人類已發現超過2 000 種與疾病相關的miRNA。即使miRNA 的檢測方法眾多,但有部分學者認為,想要真正證明miRNA 的作用和位置,原位雜交(ISH)技術必不可少。因此,本文從探針、標記物、檢測系統等方面總結ISH 技術的當前進展,分析探討其優勢和局限性,為臨床病理檢測提供新路徑。

1 ISH 概述

ISH 是指通過已知特定的標記探針與組織樣本中待檢測的分子特異性結合的分子檢測技術,廣泛用于分子和細胞病理學研究領域。ISH 起源于20世紀70年代,最初是由美國耶魯大學的Gall 等〔1〕使用核糖體基因探針確定其定位于卵母細胞的核仁中。同年,Buongiorno-Nardelli 等〔2〕在中國倉鼠組織切片中使用3H 標記的rRNA 探針,首次成功使用ISH。由于同位素標記探針使用范圍局限,傳統生物標記法和核酸探針不斷改良,ISH 檢測范圍也從提供基因和染色體的相對位置關系逐漸擴展到原位檢測RNA 和miRNA。MiRNA 是一類長約22 個核苷酸的非編碼小RNA 分子。它們通常在介導轉錄后發生基因沉默。因其不作為蛋白質合成的直接模板不能進行免疫組化檢查。其中能對單個細胞水平和定位了解的唯一方式就是ISH。2006年,Nelson等〔3〕首次使用ISH 檢測miRNA。近年來隨著ISH在miRNA 研究的重要性不斷提高,其檢測方法也不斷細化。從材料上看,已經報道的miRNA ISH 實驗方案中包括應用石蠟組織切片、低溫冷凍組織切片和細胞等。由于石蠟包埋組織塊便于長期保存,有利于回顧性研究,因此石蠟組織切片在miRNA ISH技術中應用最為廣泛。

2 ISH 技術優勢

2.1 定位效應 由于miRNA 分子量小、長度短且表達水平低、易降解,因此主要采用聚合酶鏈反應(PCR)、微陣列雜交、基因克隆和ISH 等方法檢測miRNA 的表達情況。由于前幾種方法雖然能定量顯示miRNA 的表達,但都無法檢測miRNA 在組織或細胞中的定位情況。而ISH 的優勢在于其能監測miRNA 在細胞和亞細胞的分布和組織學定位,并確定其空間表達譜。一般來說,miRNA 定位于細胞核、細胞質或是細胞外基質十分重要。Eckstein等〔4〕使用免疫熒光雙重染色對前列腺癌細胞中的miRNA 進行定位。研究表明,miR-375 主要定位于腫瘤細胞尤其是腔腺細胞的核仁中。而在模式4 組(GP4)和淋巴結轉移標本中,miR-145 在間質細胞中僅在細胞核中表達,而在腫瘤細胞中不表達。

此外,在小鼠腦組織中miRNA 的表達部位也各有特點。其中,miR-9 主要位于梨狀皮質、海馬CA和DG 區,而miR-100 主要在DG 的亞顆粒區,在海馬CA1 和基底外側杏仁核中強烈表達。除了正常組織功能定位,腫瘤組織及癌旁組織中miRNA 的表達及定位的差異尤為重要〔5〕。通過ISH 對比同一區域非小細胞肺癌組織和正常肺組織的miRNA-148a 的表達水平,發現在癌組織中miRNA-148a 弱染色,而鄰近正常肺組織中呈現強染色,表明miRNA-148a 在肺癌組織中被下調〔6〕。

2.2 半定量分析 除了進行組織定位,ISH 還可以聯合其他生物學方法進行定量分析。在黑色素瘤細胞中,miR-21 和miR-125b 存在異常表達。數字圖像分析定量的ISH 進一步顯示miR-21ISH 在黑色素瘤中表達增加,而miR-125b 的定量顯示在痣和黑色素瘤中表達一致〔7〕。Nizyaeva 等〔8〕通過石蠟切片和地高辛(DIG)ISH 檢測先兆子癇和晚期子癇前期孕婦胎盤絨毛中miRNA-146a 和miRNA-155 的表達。與足月妊娠相比,先兆子癇晚期孕婦絨毛細胞中miRNA-155 和miRNA-146a 的表達均減少〔8〕。另外,Wang 等〔9〕通過ISH 發現,在正常的胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞中均有miR-214 的表達,且胃癌組織中的表達程度明顯降低。

3 在miRNA 檢測中ISH 方法進展

經典的ISH 過程是依賴于核酸探針與固定細胞或組織中特異性序列互補,并通過顯色、熒光或電子顯微鏡等方法可視化雜交探針來進行檢測。在miRNA 檢測中,影響ISH 技術效果的關鍵變量主要包括使用探針的類型、標記物和檢測系統。其中,多數新型ISH 技術可通過調整方法變量達到期望要求,以下將分別追蹤這3 個方面的進展闡述ISH 的發展過程。

3.1 探針發展 探針設計是ISH 實驗中關鍵步驟之一,常見的探針包括寡核苷酸探針、cDNA 探針和cRNA 探針〔10〕。通常用于甲醛溶液固定或石蠟切片的探針最佳大小為20～500 個堿基對。miRNA 檢測中常見的ISH 探針,見表1。但在miRNA 原位雜交實驗中,由于miRNA 尺寸較短,傳統的DNA 或RNA 探針與靶序列結合的親和力較低。因此,許多學者通過修飾探針組件提高探針與靶標的親和力和特異性用于改進ISH 在miRNA 中的應用。目前miRNA ISH 探針分為2 類:線性探針或“擴增”探針。

表1 常見的ISH 探針

3.1.1 線性探針 LNA 是最廣泛用于miRNA ISH探針之一,也被視為是miRNA 特異性診斷的金標準。其結構主要是通過2′-O、4′-C 構成亞甲基橋,將核酸鎖在C3′內構象中。與傳統寡核苷酸探針相比,使用具有LNA 合成的探針能適應更高的雜交溫度,且穩定所得的雙鏈體達到更高的特異性。Chu等〔18〕使用雙地高辛標記的LNA 探針檢測結果顯示44%原發甲狀腺癌患者miR-21 呈現出強表達。雖然其優勢明顯,但其價格昂貴也相對限制其使用范圍。因此,在LNA 探針基礎上進行修飾是目前較為主流的探針選擇。早期發現在LNA 探針3、6、15、20 位的堿基處添加2′-氟修飾的RNA 殘基(2′-F RNA) 后miR-146b 和miR-375 穩定性增強〔19〕。2019年,Azevedo 等〔20〕發現2′-O-Me 修飾的探針能克服熒光原位雜交分析(DNA-FISH)低細胞通透性、低親和力和低核酸敏感性等缺點。可見LNA 和2′-O-Me 結合探針比其他探針具有更高的設計靈活性。2020年Minogue 等〔21〕提出可利用核糖使LNA探針在2′-O 與4′-C 之間形成橋連結構,修飾的探針有利于增加反應的特異性并允許較低的信噪比。而基于此的ISH 技術能使miRNA 如miR-35-3p 在雌雄同體的性腺中以單細胞分辨率重復顯示〔21〕。

3.1.2 “擴增”探針 為增加低頻度miRNA 分子信號強度,與序列擴增技術結合的探針開始應用于ISH 中。“擴增”探針相比于線性探針,其不僅可以成功檢測miRNA,而且還可以進一步檢測序列。比如環形探針一般是通過DNA 連接酶使線性DNA 探針退到兩端特定序列后進行環化。形成的圓環結構能通過滾輪效應進一步放大信號甚至延長序列。起初,Ge 等〔22〕通過在體外將探針與DNA 鏈接酶結合,然后形成環狀結構最后與靶序列雜交,檢測人肝癌SMMC-7721 細胞和正常肝臟LO2 細胞中miR-222 表達水平。此外,還有一種滾環擴增法使用的探針,利用這種探針進行的ISH 過程能在生理溫度下高特異性鑒定miRNA,并在3 小時內于單個細胞中原位觀察標記的miRNA〔23〕。

3.2 標志物發展 在大多數miRNA 原位雜交實驗中,寡核苷酸探針首選的標志物是DIG。DIG 是從洋地黃類植物(毛地黃和毛花毛地黃)中提取的類固醇物質,在敏感性和質量控制上明顯優于其他的生物標志物。2018年,Memi 等〔24〕通過使用DIG 標的LNA 探針在小鼠心臟組織切片中檢測到miRNA-182 的表達,進一步免疫染色顯示,心肌肌鈣蛋白(cTn)T 能和miRNA-182 共同定位在心肌細胞。也有報道稱,miR-138 可作為功能性腫瘤抑制因子,其與口腔鱗狀細胞轉移程度呈負相關。可通過DIG標記的miRNA 探針原位測量證實〔25〕。

除了DIG,新型的生物標志物也不斷涌現,包括羧基熒光素(6-FAM),溴脫氧尿苷(BRDU)和生物素等。2016年,Zhmurov 等〔26〕通過6-FAM 標記定位了miR-126-3p 和miR-126-5p,證實它們與動脈斑塊硬化內新生血管相關能促進疾病發展。最近,Kaur等〔27〕在視網膜細胞中利用BRDU 標記進行熒光共定位檢測Shh 信號傳導通路對視網膜再生的作用,結果發現Shh 信號通路受let-7 miRNA 的調節。BRDU 標記檢測的miRNA 穩定性更強,效果更佳。在ISH 技術發展中,生物素也是近幾年的研究熱點。與DIG 不同,如果使用生物素作為半抗原標志物,則需要同時選擇合適的生物素阻斷劑來阻止生物素與內源生物素的結合,生物素易同內源生物素存在潛在的交叉反應〔28〕。

3.3 檢測系統發展 在探索新型ISH 技術過程中,除了考慮傳統的實驗變量,更多的技術革新點主要集中在檢測系統上。間接染色法是最初在ISH 檢測中最常用的染色方法。但是由于miRNA 分子量小,表達量有限,早期染色方法明顯觀察不清miRNA 的表達,因此逐漸研發出基于放大信號的檢測系統構成二代ISH 檢測方法。LAB/LSAB 是利用高親和力的抗生素-生物素/鏈霉素標價法構成的敏感性ICH檢測方法,Diamandis 等〔29〕發現使用這種方法的親和力是抗原-抗體相互作用的103～106 倍。同時,該種檢測方法還能避免洗滌液、PH 變化對組織切片的影響,靈敏度更高。Shi 等〔30〕使用另外一種放大信號檢測miRNA 的方法,名為抗生素蛋白-生物素復合法(ABC),但在實際應用中因為其敏感度比LSAB 法低5～10 倍,晶體尺寸過大限制其滲透到細胞中,使其應用受到局限。

相比上面的檢測系統,酶標記的熒光信號放大法(ELF)在目前應用較為成熟。其主要通過磷酸酶進行發光底物裂解,沉淀出黃綠色熒光產物進行miRNA 分析。2016年,Lv 等〔31〕在食管癌患者標本中通過使用ELF 檢測發現,同比癌旁組織,在哈薩克族和維吾爾族食管癌患者中miR-21 明顯上調,miR-375 表達水平降低。隨著納米技術不斷發展,近年來將納米材料用于miRNA ISH 領域也成為一種新的檢測miRNA 的手段,同時也是目前發展最快的領域之一。Ge 等〔22〕發現納米殼層的使用能克服有機熒光團特有的困難,增加光穩定性和強度,同時使納米殼層更好地穿透細胞膜,對miRNA 靶標具有高度特異性。

綜上,miRNA ISH 已經廣泛用于臨床診斷。盡管ISH 是唯一能夠定位miRNA 的方法,但其仍然具有局限性。一方面,ISH 的定量效應是不完全的,只能結合其他檢測方法進行實際量化。同時,雖然能原位捕獲miRNA 但仍然沒有辦法區分其功能狀態。另一個不能忽視的方面是ISH 的單分子檢測效率低,固定要求高。因此,如何克服ISH 技術在miRNA 檢測上的局限性優化是目前需要解決的問題。