跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀干預對AMI大鼠心肌細胞活性、能量代謝及SPRED1蛋白的影響

李景輝 李婷婷 吳興森 曾丁鄰 ( 漳州正興醫院,福建 漳州 363000; 漳州市第三醫院)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動脈發生急性或持續性的缺血缺氧,從而引發的心肌壞死〔1〕。該疾病在歐美地區最為常見,美國每年約有150 萬人患AMI,目前中國急性心肌梗死的發病率也顯著上升,每年新增患者達20 萬以上〔2〕。AMI 發病時患者梗死心肌呈凝固性壞死,病灶區伴充血、水腫及炎性細胞浸潤癥狀急性期結束后,梗死心肌將被纖維組織代替,誘發心室增大、心肌代償性肥厚,并影響心臟收縮和舒張功能,進而影響患者的預后,而心肌收縮功能與心肌能量代謝密切相關〔3,4〕。能量代謝是心臟活動的物質基礎,三磷酸腺苷(ATP)是維持心臟正常生命活性的直接能量來源,改善梗死心肌的能量代謝可有助于減輕急性心肌缺血再灌注損傷〔5〕。SPRED1 蛋白是Sprouty 家族的相關蛋白,目前有研究證實,SPRED1 蛋白在很多組織中均有表達,可參與骨形態進展,在造血的過程中同時SPRED1 會誘導氣道嗜酸細胞大量增多〔6〕。多項研究發現,SPRED1 在胚胎的多個器官組織,如大腦,心臟和肺等均呈現低表達,同時顯示出SPRED1 在胚胎發育期間占有重要地位〔7〕。運動訓練是心肌梗死后康復訓練的重要方式之一,現有研究表明,適宜的運動訓練不僅可以提高心肌梗死后心臟的舒縮功能,而且可以減輕梗死后的心室重構〔8〕。瑞舒伐他汀是一種新研究的他汀類藥物,對抗炎癥、抗氧化和調節免疫力有顯著的作用,也因此受到臨床上的廣泛關注〔9〕。目前有研究證實,瑞舒伐他汀對心肌梗死后心功能的作用,心肌細胞的凋亡情況和心室重塑均有明顯的改善,但對與瑞舒伐他汀對改善的作用機制尚不清楚〔10〕。本研究探討跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀對AMI 大鼠心肌細胞活性和能量代謝的作用機制及其對AMI 大鼠中SPRED1 蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性大鼠購自吉林大學基礎醫學院動物實驗中心,共計50 只。體重250～300 g,常溫下適應性飼養大鼠7 d。

1.2 試劑和儀器 HX-100E 小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);生物信號采集分析系統(成都邀生電子有限公司);PCR 擴增儀(美國Applied Biosystems);DYY-6C 電泳儀(北京市六一儀器廠);BX41 顯微鏡(日本Olympus 公司);瑞舒伐他汀鈣片(阿斯利康制藥有限公司);水合氯醛(天津市科密歐化學實際有限公司);ATP 酶試劑盒(南京建成公司);SPRED1 兔多克隆抗體(Santa Cruz 公司);DAB 顯色試劑盒(上海易利生物科技有限公司)。

1.3 動物分組與模型建立 把50 只大鼠分為5 組,每組10 只。假手術(sham)組;AMI 大鼠模型(AMI)組,AMI 大鼠給予跑臺訓練進行干預組(train組);AMI 大鼠給予瑞舒伐他汀干預組(Ros 組);AMI 大鼠模型給予跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀干預組(train+Ros 組)。把所有實驗大鼠進行麻醉處理,給大鼠氣管插管后,鏈接呼吸機和心電圖機,對手術的部位進行消毒,在第3～4 肋之間,從左到右把皮膚剪開,分離大鼠的肌肉后取出心臟,結扎大鼠的左冠狀動脈前降支部位。當大鼠左室前壁的心肌部分發白,收縮功能明顯變弱,心電圖機上顯示ST 段有顯著升高時,說明成功造模。sham 組除了對左冠狀動脈前降支不結扎外,其他的手術步驟和其余兩組相同。手術后各組連續注射3 d 的青霉素溶液,以防止術后有感染的情況發生。

造模成功后,sham 組、AMI 組及train 組給予等體積量蒸餾水灌胃,1 d/次;Ros 組及train+Ros 組每只大鼠給予0.5 mg 瑞舒伐他汀灌胃;train 組及train+Ros 組每天早晚各進行1 次30 min 的跑臺運動,每周運動5 d,跑步機的轉速為16 m/min;所有大鼠連續干預4 w。

1.4 標本采集 分別測定每組大鼠的心功能。4 w后,開胸后再次鉗夾左前降肢,于頸靜脈注射2%伊文思藍2～3 ml,確定未缺血區和缺血區,并經耳緣靜脈推注10%氯化鉀(KCl),使心臟停于舒張期,剪下心臟,摘取所有大鼠的心臟后,沿著左心室的長軸把心臟的梗死區分為兩份,取出梗死區的組織,sham組取相同位置的組織,部分用于蘇木素-伊紅(HE)染色實驗,另一部分用液氮進行保存,用于蛋白的檢測。

1.5 大鼠心功能指標測定 給藥結束后麻醉所有大鼠,檢測大鼠的左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)的心功能指標,以上4 項指標均測量3 次,取平均值。

1.6 TCC 法檢測心肌梗死面積 用生理鹽水洗凈心臟后,用保鮮膜包裹好置于-20℃冷凍30～60 min。取出心臟,使用刀片小心將心臟橫切5 片置于培養皿中,用1%TTC 溶液30℃避光染色10～15 min,取出心臟,小心將心臟翻面,繼續37℃避光染色10～15 min。用相機拍照后并計算梗死區域的面積。

1.7 心肌組織病理學形態觀察 制備心肌組織切片,每個樣本取不連續3 張切片,常規脫蠟至水,蘇木精液染色、75%鹽酸乙醇分化、氨水處理、酸化伊紅乙醇染色處理后水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固,光鏡下觀察。

1.8 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡 取出大鼠的心肌組織,分別切成0.5 cm 的塊狀,固定后石蠟包埋、把組織進行切片。用TUNEL 法把石蠟切片進行染色,所有的步驟按照試劑盒上的說明嚴格進行。每張石蠟切片選取5 個不交叉的視野進行觀察,凋亡的心肌細胞為深棕色。細胞凋亡率=細胞凋亡的數量/細胞的總數×100%。

1.9 心肌ATP 酶活力檢測 每組取部分心臟,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗血跡,用組織勻漿機制備勻漿,離心機3 500 r/min,離心10 min 后取上清液,蛋白濃度采用考馬斯亮藍法定量,定磷法于660 nm 下檢測A 值,并計算ATP 酶活力(以每小時每克心肌組織蛋白產生mmol Pi 單位酶表示),實驗步驟參考試劑盒說明書嚴格進行。

1.10 Western 印跡檢測SPRED1 蛋白表達 將各組的心肌組織分別提取100 mg,組織裂解并提取核蛋白,分裝后,-20℃保存。將蛋白溶液與緩沖溶液按照4 ∶1比例進行混均,然后將其煮沸,使其變性。在電泳板內分別注入50 μm 的蛋白樣品,把電泳后的樣品轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉,并進行封閉,時常為1 h。加入1 抗后進行TTBS 漂洗,每次漂洗10 min,一共進行3 次漂洗,最后加入2 抗對溶液進行稀釋,再在常溫的環境中封閉1 h。取出PVDF 膜,TTBS 漂洗10 min×3,二氨基聯苯胺(DAB)顯色后數碼相機照相。

1.11 統計學分析 采用SPSS19.0 軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 各組心功能指標比較 與sham 組比較,AMI組LVEDD 和LVESD 均顯著升高,LVEF 和LVFS 顯著降低(P＜0.05);干預后train 組、Ros 組和train+Ros 組LVEDD 和LVESD 均低于AMI 組,而LVEF和LVFS 明顯高于AMI 組,并且3 組效果呈遞增排列,train+Ros 組心功能水平優于train 組、Ros 組(P＜0.05),見表1。

2.2 各組心肌梗死面積比較 sham 組心肌組織無梗死情況。AMI 組、Train 組、Ros 組和Train 組+Ros組均出現了梗死的組織,并且心肌梗死面積呈遞減排列,AMI 組心肌梗死面積最大,train+Ros 組心肌梗死面積明顯低于train 組和Ros 組(P＜0.05),見表1。

表1 各組心功能、心肌梗死面積比較(±s,n=10)

表1 各組心功能、心肌梗死面積比較(±s,n=10)

與sham 組比較:1)P＜0.05;與AMI 組比較:2)P＜0.05;與train 組比較:3)P＜0.05;與Ros 組比較:4)P＜0.05;下表同

組別LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)LVFS(%)心肌梗死面積(%).00±0.00 AMI 組6.26±0.511)10.41±0.481)52.05±2.831)27.73±1.051)52.68±7.811)train 組5.31±0.481)2)8.72±0.431)2)58.17±2.561)2)31.54±1.111)2)38.31±5.121)2)Ros 組4.89±0.451)2)3)7.95±0.511)2)3)61.37±2.031)2)3)33.49±0.981)2)3)29.67±5.181)2)3)train+Ros 組4.21±0.321)2)3)4)6.77±0.641)2)3)4)69.62±1.961)2)3)4)38.21±0.721)2)3)4)23.51±6.711)2)3)4)F/P 值51.41/＜0.001133.20/＜0.001224.90/＜0.0014 sham 組3.92±0.215.57±0.6378.16±0.7643.62±0.430 74.20/＜0.001119.40/＜0.0001

2.3 各組心肌組織病理學形態比較 sham 組心肌細胞均整齊排列,心肌細胞的邊界也很清晰,細胞核及橫紋清楚可見。與sham 組比較,AMI 組、train組、Ros 組和train+Ros 組心肌細胞出現明顯的損傷,并且在細胞的梗死區均出現了炎性細胞的浸潤,細胞的損傷程度從重到輕分別為AMI 組、train 組、Ros 組、train+Ros 組,并且train+Ros 組心肌細胞排列也趨于整齊,炎癥細胞浸潤明顯減少,在梗死區周邊可見血管組織,明顯優于AMI 組、train 組、Ros 組,見圖1。

圖1 各組心肌組織(HE 染色,×400)

2.4 各組心肌細胞凋亡TUNEL 檢測結果比較 和sham 組〔(5.12±0.46)%〕相比,AMI 組心肌細胞凋亡率顯著增加〔(39.87±1.63)%,P＜0.05〕;和AMI組相比,train 組〔(34.18±1.21)%〕、Ros 組心肌細胞凋亡率〔(39.27 ± 1.35)%〕 和train + Ros 組〔(18.36±0.87)%〕均明顯降低(P＜0.05),且train+Ros 組心肌細胞凋亡率明顯低于train 組、Ros 組(P＜0.05),見圖2。

圖2 各組心肌細胞凋亡(TUNEL 染色,×400)

2.5 各組心肌ATP 酶活力比較 和sham 組比較,AMI 組ATP 酶活力顯著降低(P＜0.05);干預后的train 組、Ros 組和train+Ros 組ATP 酶活力顯著高于AMI 組(P＜0.05),且train+Ros 組ATP 酶活力高于train 組和Ros 組(P＜0.05),見表2。

表2 各組心肌ATP 酶活力比較(±s,n=10)

表2 各組心肌ATP 酶活力比較(±s,n=10)

組別Na+-K+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)Ca2+-Mg2+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)5.68±0.796.73±1.05 AMI 組4.22±0.801)5.40±0.761)train 組4.79±0.921)2)5.98±1.131)2)Ros 組4.85±0.441)2)3)6.19±0.901)2)3)train+Ros 組5.21±0.291)2)3)4)6.56±0.651)2)3)4)F/P 值sham 組6.119/0.000 53.267/0.019 6

2.6 各組SPRED1 蛋白表達比較 AMI 組SPERD1 蛋白表達(2.23±0.15)顯著高于sham 組(1.00±0.02,P＜0.05);與AMI 組比較,train 組、Ros 組和train+Ros 組SPERD1 蛋白表達均顯著降低(1.45 ± 0.11、1.03 ± 0.09、0.68 ± 0.06,P＜0.05),且蛋白表達呈逐漸遞減趨勢,train+Ros 組心肌組織中SPERD1 蛋白低于train 組和Ros 組(P＜0.05),見圖3。

圖3 各組SPRED1 蛋白表達

3 討 論

研究表明,藥物預處理和運動對受損的心肌組織均具有保護作用,可有效地降低心律失常發生率、改善心臟的收縮功能、增強心臟對損傷的耐受能力等〔11〕。前期有研究顯示,瑞舒伐他汀在急性冠狀動脈綜合征中發揮抗氧化作用,有效降低氧化應激水平及心肌損傷標志物的水平〔12〕。研究指出,運動能夠增加機體氧容量,阻止一些代謝疾病的發生;運動訓練還能通過調節一氧化氮通路,影響血管舒張,從而阻礙心臟疾病中內皮細胞的死亡,適當強度的運動訓練還可減少心血管疾病的發生〔13〕。

瑞舒伐他汀對細胞內膽固醇合成過程中限速酶的活性具有一定的抑制作用,即可抑制膽固醇的合成,膽固醇合成量降低將導致細胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體上調,血漿LDL 代謝加快〔14〕。瑞舒伐他汀還可抑制極低密度蛋白的生成,在高膽固醇血癥治療工作中具有極高療效。臨床研究發現,對急性冠脈綜合征患者進行大劑量瑞舒伐他汀治療后,患者心肌梗死、心絞痛、死亡等發生率下降20%左右,腦卒中發生率也顯著下降。本研究結果提示,跑臺訓練和瑞舒伐他汀的聯合使用可明顯改善AMI大鼠的心功能,對心肌細胞的凋亡也能進行有效的抑制,但跑臺訓練和瑞舒伐他汀聯合干預的效果最好。李丹等〔15〕研究發現,心肌梗死急性期即進行中等強度的跑臺訓練可提高大鼠的存活率,還能有效減小缺血心肌的梗死面積,改善左心室重構。吳春濤等〔16〕對AMI 大鼠研究發現,瑞舒伐他汀可改善AMI 大鼠心臟功能,可能通過調節基質金屬蛋白酶(MMP)2/9/10、Perionstin 蛋白及TGF-β1 的mRNA表達來調控其心肌重構。

能量代謝是心臟活動的物質基礎,ATP 是維持心臟正常生命活動的直接能量來源,有研究表明,心肌ATP 的水平與其收縮能量呈正相關,而能量代謝的恢復能夠減輕細胞損傷也被證實〔17,18〕。本研究結果顯示,AMI 組大鼠心肌細胞發生損傷,進而導致ATP 生成不足,導致心肌細胞能量代謝障礙,跑臺訓練和瑞舒伐他汀均可促進ATP 大量生成,但跑臺訓練和瑞舒伐他汀聯合使用的效果最佳,可見跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀干預可顯著增加ATP 的生成,恢復受損心肌細胞的能量代謝功能。劉媛媛等〔19〕通過對動物進行8 w 的跑臺訓練后發現,適度的運動對心肌能量的代謝可進行一定程度的優化,并且使心肌代謝轉化糖酵解和葡萄糖,但對脂肪酸的利用無顯著的變化。本研究結果提示,跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀可對心肌組織血管新生負性調控因子SPRED1 進行有效的調節,進而調節血管的新生。鄭瑞玲等〔20〕研究發現,活血益氣方可促進AMI 大鼠梗死邊緣區血管的新生,治療效果較為顯著,其作用機制通過下調SPRED1 的表達發揮作用,這與本文研究結果相似。

綜上,跑臺訓練聯合瑞舒伐他汀可有效減少急性心肌梗死細胞的凋亡,改善心肌能量代謝,同時對SPRED1 的表達有一定的抑制作用。