超高壓射流處理對大腸桿菌和沙門氏菌的影響

張歆

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

超高壓射流是一種新型的非熱殺菌技術(shù)，在液體食品中起到良好的殺菌作用。傳統(tǒng)的滅菌技術(shù)簡單而可控，雖然在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多[1]，但對食品的感官質(zhì)量和營養(yǎng)成分受到很大損害，無法達(dá)到現(xiàn)代食品最小化加工的需要[2]。

超高壓射流是借助往復(fù)式高壓泵將普通的水流增壓，使其到達(dá)數(shù)百大氣壓之后，再從定制的高壓噴嘴中發(fā)射出來，形成高速水射流，具有很強(qiáng)的穿透性[3]。過該技術(shù)處理的食品，由于所含的微生物蛋白質(zhì)等受到壓力凝固，酶失去活性和功能，細(xì)胞膜發(fā)生泄漏[4]，達(dá)到殺菌的效果，從而保證產(chǎn)品的安全性和較好的品質(zhì)[5]。高壓射流的滅菌方法屬于動態(tài)滅菌法，和靜態(tài)超高壓相比具有處理量大，能保證食品的安全性，避免由高溫殺菌引起的產(chǎn)品變質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[6]，液體食品的規(guī)模化殺菌方面具有良好運(yùn)用前景。

大腸桿菌和沙門氏菌是食品中常見的污染微生物，國內(nèi)外每年都會發(fā)生大腸桿菌和沙門氏菌食物中毒事件，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌性的食物中毒所占比例達(dá)70%是由沙門氏菌引起的[7]，研究顯示，大腸桿菌、毒素和豬霍亂沙門氏菌是導(dǎo)致小豬仔腹瀉的主要致病菌[8]，因此，對于這兩種致病菌進(jìn)行研究對公共衛(wèi)生和食品安全具有重要意義[9]。

Lee等[10]對超高壓結(jié)合熱處理對蘋果汁中酸土芽孢桿菌的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在207 MPa壓力下，45 ℃處理10 min或在71 ℃處理1 min就能夠?qū)⒒畹逆咦訑?shù)量降低3.5個對數(shù)級。當(dāng)微波功率為20 W，處理時(shí)間大于12.5 min時(shí)，沙門氏菌的數(shù)量下降了9.22 logCFU/mL，而在比20 W高的其他功率和處理時(shí)間1.5～2 min條件下，顯示了極低的微生物存活，這是Portela等人[11]在對沙門氏菌的滅活殺菌所得出的發(fā)現(xiàn)。張根生等[12]發(fā)現(xiàn)過高的壓力會使鮮雞蛋的蛋白質(zhì)變性、白度和粘度上升，起泡性和感官評分下降。由此可見，在適合的壓力和溫度組合條件下，超高壓殺菌可以達(dá)到理想的效果。

本文以大腸桿菌和沙門氏菌為研究對象，考察超高壓射流對微生物的殺滅效果，通過對滅菌效果評價(jià)選擇最佳的超高壓射流的壓力和溫度，為非熱殺菌技術(shù)應(yīng)用于果汁、蛋液等液體食品的殺菌提供參照基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli），ATCC8739NA；減毒鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），ATCC14028，實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

酵母提取物、蛋白胨、瓊脂（北京奧博星）；氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

超高壓射流設(shè)備，工作壓力0～300 MPa，工作流量2.6 L/h，本實(shí)驗(yàn)室自制；電熱恒溫水浴鍋HWS-28，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162，上海一恒；高壓蒸汽滅菌鍋YM75FGN，上海三申；負(fù)壓超凈工作臺FCH-900，北京亞泰科隆。

1.2 方法

1.2.1 微生物的活化

使用LB平板培養(yǎng)基，活化大腸桿菌菌種，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；沙門氏菌菌種接種到緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h。將活化后的大腸桿菌、沙門氏菌用平板劃線的方法分離出單菌落，從中挑出單菌落分別接種至LB斜面培養(yǎng)基，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備

用移液槍準(zhǔn)確吸取2μL活化后的大腸桿菌、沙門氏菌培養(yǎng)液，分別接種到已編號的裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，接種后振蕩培養(yǎng)（150 r/min，30 ℃)，分別在0、3、6、9、10、12、15、18 h取樣，放入4 ℃冰箱，以未接種的 LB培養(yǎng)基作空白對照，用600 nm波長進(jìn)行比濁測定，測定吸光值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。再以生長曲線劃分出大腸桿菌不同生長期，根據(jù)生長曲線選取培養(yǎng)一定時(shí)間的菌液來達(dá)到大致控制殺菌過程中樣品的初始菌數(shù)。

1.2.3 超高壓射流處理菌液

在將料液置于進(jìn)料口后由泵將料液吸入，設(shè)定壓力后待壓力上升到目標(biāo)壓力后進(jìn)行射流處理，整個壓力上升并穩(wěn)定的過程約持續(xù)5 min左右。通過調(diào)整不同目標(biāo)壓力以達(dá)到測定不同壓力的室溫下，維持釜內(nèi)的溫度恒定，選取5個出口溫度（20、25、35、40、45 ℃） ，研究不同的溫度對于殺菌效果的影響；選取3個壓力條件（100、200、300 MPa），探究不同的壓力對于殺菌效果的影響。

1.2.4 微生物數(shù)量的測定

參照 GB/T 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[13]，在樣品殺菌前和殺菌后對菌液樣品進(jìn)行菌落總數(shù)檢測。平板在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，設(shè)定培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間 48 h，培養(yǎng)完成后篩選出菌落數(shù)30～300 CFU之間的培養(yǎng)皿，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原菌液的菌數(shù)。

1.2.5 致死率計(jì)算

參考李霜等[14]方法計(jì)算，微生物致死率用對數(shù)值log10S來表示。其表達(dá)式為：

式中：

Log10S——為前后菌落總數(shù)降低的對數(shù)；

N0——超高壓處理前樣品中菌落總數(shù)cfu/mL；

N——超高壓處理后樣品中菌落總數(shù)cfu/mL；

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌和沙門氏菌的生長曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件培養(yǎng)大腸桿菌和沙門氏菌，通過測定吸光值，繪制大腸桿菌和沙門氏菌的生長曲線，結(jié)果見圖1和圖2。在培養(yǎng)前10 h，大腸桿菌與沙門氏菌的生長呈快速上升階段，對應(yīng)的菌液的吸光值也近乎呈直線上升，在培養(yǎng)10 h后兩者的生長進(jìn)入了平穩(wěn)期，菌液的吸光值均不再變化，因此選擇培養(yǎng)10 h后的大腸桿菌培養(yǎng)液和沙門氏菌培養(yǎng)液作為樣品進(jìn)行殺菌試驗(yàn)。

圖1 大腸桿菌生長曲線

圖2 沙門氏菌生長曲線

2.2 大腸桿菌的處理效果

在溫度20、25、35、40、45 ℃和100、200、300 MPa壓力條件下，進(jìn)行殺菌試驗(yàn)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算大腸桿菌菌落總數(shù)和致死率，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同溫度下進(jìn)樣前后大腸桿菌菌落總數(shù)變化

圖4 大腸桿菌致死率變化

由圖3、圖4可見，在20～45 ℃、200 MPa壓力下處理對于大腸桿菌殺菌效果明顯，當(dāng)壓力超過200 MPa大腸桿菌含菌量下降速度加快，隨著溫度升高，大腸桿菌的存活量下降速率明顯減弱，隨著溫度和壓力的升高大腸桿菌致死率也在上升，呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，在300 MPa 以上殺菌效果明顯。

2.3 沙門氏菌的處理效果

在溫度20、25、35、40、45 ℃和100、200、300 MPa壓力條件下，進(jìn)行殺菌試驗(yàn)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法測定沙門氏菌致死率，結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 不同溫度下進(jìn)樣前后沙門氏菌菌落總數(shù)變化

圖6 沙門氏菌致死率變化

由圖5、圖6可見，在20～25 ℃、100 MPa壓力下處理對于沙門氏菌殺菌效果明顯，當(dāng)壓力超過100 MPa進(jìn)入了超高壓階段，沙門氏菌含菌量下降速度加快；隨著溫度上升，沙門氏菌的存活量呈下降趨勢；溫度和壓力的升高，沙門氏菌致死率也在上升，呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，因此可以認(rèn)為在200 MPa以上殺菌效果明顯。

3 小結(jié)與討論

本文利用超高壓射流對大腸桿菌和沙門氏菌培養(yǎng)液殺菌，均引起兩種微生物都不可逆轉(zhuǎn)的損傷并致死。當(dāng)在超高壓時(shí)，結(jié)合不同溫度與壓力進(jìn)行處理，大腸桿菌和沙門氏菌的含菌量急劇下降，隨著超高壓射流壓力的上升，菌液中細(xì)菌的致死率逐步上升，呈現(xiàn)先快后慢的趨勢；隨著超高壓射流溫度的上升，兩種微生物的減少趨勢明顯。

大腸桿菌與沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，屬于敏感型致病微生物，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中肽聚糖層很薄，所以對溫度、壓力越高就越敏感；大腸桿菌在25 ℃下，壓力為300 MPa時(shí)即可被完全殺滅，而沙門氏菌在100～200 MPa時(shí)被完全殺滅。