星形膠質細胞U251穩轉FOXO1基因細胞系構建及其蛋白互作生物素驗證

曾 挺，郭媛媛，郭婕妤，劉 超，劉 武

(湖北科技學院醫學部 1.藥學院、2.糖尿病與心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPIs)是細胞生命活動的基礎，以BioID和APEX為代表的蛋白質鄰近標記技術逐漸被應用于蛋白質相互作用研究[1, 2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氫鍵、鹽鍵和疏水相互作用力進行，它們的空間距離都非常的短，所以通常認為互作的蛋白必定相互鄰近[3]。TurboID是一種比BioID或APEX具有更高催化效率的蛋白質(標記時間從18 h縮短至10 min)，由于很多蛋白發揮的結合與催化作用是很短暫的，理論上利用這個技術可以找到一些比較新穎的結合蛋白[4]。大量研究表明，FOXO1調控許多靶點，如參與細胞凋亡和自噬的基因、抗氧化酶、細胞周期阻滯基因以及代謝和免疫調節因子[5-6]，被認為是一種具有復雜活性的超級轉錄因子。因此，我們將利用TurboID的高效性來尋找FOXO1的互作蛋白。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人胚腎上皮細胞株293T及星形膠質細胞株U251，均保存于實驗室。脂質體核酸轉染試劑、胰酶、嘌呤霉素和慢病毒濃縮試劑盒，均購自上海翊圣生物科技有限公司;銀染試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；相關抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；全基因合成、引物及測序服務均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 FOXO1-TurboID過表達質粒的構建TurboID-flag基因序列經全基因合成并替換EGFP連接上plenti-cmv-EGFP質粒，即為plenti-cmv-TurboID，以人的cDNA為模板擴增FOXO1基因(引物FOXO1-F：ATAGAAGACACCGACTCTAG AATGGCCGAGGCGCCTCAG；FOXO1-R：GGGGTATACGTATACGGATCCGCCTGACACCCAGCTATGTGTC)，將其片段重組上線性化的plenti-cmv-TurboID質粒。經轉化，涂板，篩選陽性克隆，提取質粒經酶切鑒定后送公司測序，測序正確的質粒命名為FOXO1-TurboID。

1.3 FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP質粒的慢病毒包裝將質粒FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP分別與慢病毒包裝質粒利用293T細胞進行慢病毒包裝，再使用慢病毒濃縮試劑將細胞培養基進行處理得到病毒濃縮液。

1.4 構建FOXO1過表達細胞系及其驗證將攜帶有FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP質粒的病毒濃縮液對U251細胞進行感染處理，通過觀察感染plenti-cmv-EGFP質粒細胞的熒光強度和嘌呤霉素的抗性篩選，以及western-bolt蛋白電泳判斷細胞系是否穩轉成功。攜帶有plenti-cmv-EGFP質粒的細胞命名為EGFP-U251，攜帶有FOXO1-TurboID質粒的細胞命名為FOXO1-U251。

1.5 基于TurboID的鄰近生物素標記技術參照Branon等報道的方法[4]分3組進行12 h生物素標記實驗，分別為EGFP-U251細胞、FOXO1-U251細胞以及使用飽和脂肪酸(棕櫚酸，PA)模擬高脂環境處理12 h的FOXO1-U251細胞。

1.6 生物素標記蛋白親和純化以及銀染色法鑒定收集1.5中的3組實驗細胞，利用Beads磁珠進行蛋白的親和純化，再將純化后的磁珠進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，銀染色法觀察EGFP-U251細胞、FOXO1-U251細胞以及經過PA處理后的FOXO1-U251細胞，通過蛋白條帶的差異判斷是否尋找到大量互作蛋白。

2 結果

2.1 FOXO1-TurboID過表達質粒的構建FOXO1-TurboID過表達質粒的組成包含目的基因FOXO1、生物素標記酶TurboID、核定位信號NLS和標簽蛋白Flag，以及兩個不同的抗性篩選標簽。已經過公司測序，序列正確。

2.2 FOXO1-TurboID過表達穩轉細胞系的構建與驗證經嘌呤霉素篩選后觀察EGFP-U251細胞系，熒光顯微鏡下有明顯的綠色熒光，可知EGFP-U251穩轉細胞系構建成功。之后對經過嘌呤霉素篩選后的細胞系進行Western blot蛋白電泳驗證，確定FOXO1-TurboID過表達穩轉細胞系的構建成功。

2.3 生物素標記及銀染色法鑒定將“1.5”中3組細胞經過12 h生物素標記實驗后，利用磁珠拉取標記有生物素的蛋白，再進行銀染色法鑒定，觀察到FOXO1穩轉細胞系與對照組EGFP-U251細胞系蛋白條帶之間的巨大差異，證明已經拉到大量與目的基因FOXO1互作的蛋白，FOXO1-U251細胞與經過PA處理后的FOXO1-U251細胞之間的表達差異有待于進一步的質譜分析。

3 討論

目前已知受FOXO調節的基因主要包括調控細胞周期、細胞死亡、細胞自噬、細胞代謝、細胞抗氧化等相關基因，FOXO某種程度上可以看做調節一大類功能基因的“開關”，是醫藥生物以及生命科學領域重要的研究對象[7]。

在本研究中，我們構建重組FOXO1-TurboID過表達質粒，利用慢病毒包裝技術得到了可持續表達FOXO1-TurboID基因的細胞系。之后再對穩轉EGFP-U251和FOXO1-TurboID的U251細胞進行了生物素標記實驗，并對其中的一組穩定過表達FOXO1-TurboID的U251細胞進行棕櫚酸(PA)處理。經過生物素親和純化和銀染色法，EGFP-U251作為假陽性對照組可反映內源性生物素與磁珠的互作，拉取少量蛋白；而FOXO1-U251細胞與經過PA處理后的FOXO1-U251細胞這兩組均可以拉取大量互作蛋白，這兩組之間所拉取的蛋白也存在一定差異，這種差異可以反應PA處理條件下FOXO1實時拉取互作蛋白的變化，所拉取的蛋白有待于進一步的蛋白質譜鑒定。該技術的成功應用證明了TurboID鄰近標記技術的實用性和高效性，在FOXO1穩轉細胞系中的成功標記對明確該基因的功能及其參與的調控網絡奠定了基礎，對日后其他基因的研究也提供了一定的思路。