谷氨酸脫氫酶作為藥物性肝損傷潛在生物標志物的研究進展

黎 韻，向懷榮，程 旋，何 貝，彭文興,2

（中南大學1.湘雅二醫院藥學部，2.臨床藥學研究所，湖南長沙 410011）

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是人體暴露于特定藥物后由藥物本身或其代謝產物對肝的直接或間接作用而引起的肝損傷[1]。DILI是常見藥物不良反應，可導致急性肝衰竭甚至死亡等嚴重不良預后[2-3]。在中國大陸，DILI發病率約為23.8/100 000，高于西方國家的報道[4]。根據機制DILI可分為固有型和特異質型。固有型DILI是指由藥物或其代謝物直接損傷引起的DILI，與藥物劑量正相關，可預測，潛伏期短，且個體間差異不明顯。然而，大部分藥物引起的DILI是特異質型DILI。特異質型DILI通常與藥物劑量無關，個體間差異大，機制復雜，難以預防和診斷[5]。特異質型DILI難以在實驗動物復制，臨床表現多樣，是醫藥公司、患者和臨床醫生密切關注的問題。特異質型DILI不僅是藥物審批失敗、增加警示以及退出市場的重要原因，也是臨床出現不明原因肝損傷的重要原因[6]。對于DILI，迄今仍缺乏靈敏性高且特異性強的診斷標志物和有效的治療方法，存在診斷和治療兩大困難。

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）是一種變構酶，主要催化谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸的可逆反應，在胰島素穩態[7]、調節中樞神經系統[8]和癌細胞繁殖[9]中發揮著重要作用。在人體，GLDH廣泛存在于細胞內線粒體基質中，當線粒體遭到破壞時，GLDH從線粒體基質被釋放到體循環中，導致血清中GLDH水平升高。另外，GLDH作為氨基酸代謝過程的關鍵酶在肝組織中含量最高[10]。且線粒體損傷是多數DILI機制的關鍵步驟，DILI發生時，血清GLDH水平會顯著升高。因此，GLDH被視為DILI的潛在生物標志物[11-12]。最新研究表明，GLDH作為DILI的生物標志物在一定程度上優于其他傳統生物標志物[11,13]。如2019年Church等[13]進行了一項國際合作的大型前瞻性研究，對miR-122、GLDH、炎癥標志物高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等DILI的候選生物標志物進行了比較研究，發現GLDH作為DILI的診斷標志物優于其他生物標志物。

1 傳統DlLl生物標志物及其不足

傳統肝功能指標是常用的DILI診斷指標，包括谷 丙 轉 氨 酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）等。目前臨床診斷DILI的金標準為GPT，GOT，ALP和TBIL的聯合檢測。隨著金標準被廣泛應用于臨床，這些傳統生物標志物的不足逐漸顯現。首先，這些傳統生物標志物的肝特異性不強，肝以外的其他器官損傷也會導致它們的升高和假陽性診斷。如肌損傷可導致血清GPT升高；腎炎和肌損傷均可導致GOT升高[14-15]；ALP同時分布于肝組織和骨組織中，可隨成骨細胞活性的升高而升高。婦女絕經后血清中的ALP水平升高，而絕經后婦女是DILI的高危人群，易導致假陽性診斷[16]；當血紅蛋白降解增加或膽紅素轉運體發生改變時，血清中TBIL水平也會隨之升高[17]。其次，這些傳統生物標志物的靈敏性不高，部分患者在DILI發生的早期僅表現出金標準的血清水平輕微升高，甚至不升高，容易錯過最佳診療時間，發生不可逆嚴重肝損傷，甚至導致肝衰竭，最后危及生命。總之，目前臨床上使用的金標準不能早期、準確、特異地對DILI進行診斷，不利于及時對發生了DILI的患者進行干預。為更早、靈敏、特異地診斷DILI以減少DILI引起的嚴重肝損傷和死亡，尋找新的DILI生物標志物勢在必行。

2 GLDH作為潛在DlLl生物標志物的特點

關于GLDH作為DILI的潛在生物標志物已有大量相關研究。下面對GLDH作為DILI生物標志物在生物學特性、肝損傷特異性、靈敏性和穩定性等4個方面的研究進展進行綜述。

2.1 生物學特性

GLDH（EC 1.4.1.3）是由谷氨酸脫氫酶基因（NCBI序列號NC_000010.11）編碼的一種酶。哺乳動物組織中GLDH由6個相同的亞基組成的六聚體分子組成，每個亞基的相對分子質量約為5.6×104，由505個氨基酸組成的多肽鏈組成。GLDH主要催化谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸和氨，這一過程是機體獲得ATP的重要途徑。GPT（EC 2.6.1.2）和GOT（EC 2.6.1.1）是氨基酸代謝過程中重要的酶。GPT和GOT為蛋白單體，相對分子質量比GLDH小，但GLDH在結構、組織分布和功能上更保守，物種間轉化率更高[18-19]。與GPT一樣，GLDH是一種在肝組織中分布最多的酶，但兩者在肝細胞內的分布不同[10]。GPT起源于胞漿，而GLDH位于線粒體基質中[18]。GLDH在含有富含基質的線粒體的肝組織中分布最廣，而在含有富含嵴的線粒體的組織中，如心肌和骨骼肌，分布極少[19]。GLDH雖也存在于腎和神經組織中，但這些組織通常分別向管腔和腦脊液釋放酶。

2.2 肝損傷特異性

與GPT相比，GLDH的肝特異性更強。GPT是一種在肝細胞含量較高的代謝酶，在肝細胞壞死過程中，細胞膜受到損壞，GPT被釋放到血液中。然而，GPT不僅由肝細胞釋放，也能在其他器官的細胞受到損傷時從中釋放，如腎、肌肉和心臟等[10，19]。在劇烈運動[20-21]和心梗[14]后，血清GPT水平顯著升高。此外，GPT的血清水平還受人體代謝變化的影響，如饑餓、糖尿病[22-23]或某些藥物治療期間[24]均會引起GPT血清水平的變化。因此，GPT的肝損傷特異性不足。GLDH雖在腎、胰腺、大腦和腸道有少量表達，在肌組織中也有微量表達，但主要在肝小葉中均勻表達[10]。基于GLDH的肝損傷特異性比GPT更強，美國FDA在2020年已批準了臨床應用GLDH代替GPT聯合其他生物標志物（如TBIL，GOT和ALP）作為肌損傷患者的肝損傷生物標志物[25]。

2.3 靈敏性

GPT等傳統生物標志物不能較早診斷出DILI，存在患者病情嚴重而血清中的GPT水平仍處于正常水平的情況[26]。GLDH相較于傳統生物標志物能更早地診斷出DILI，靈敏性更高。有研究顯示，隨著肝損傷的加重，相較于GPT，血清GLDH水平的升高能更早地被檢測到[27]。在蒼耳子水提取物致大鼠肝損傷研究中，可以觀察到動物輕微肝損傷時GLDH明顯升高，而傳統生物標志物（如GPT和GOT）血清水平并未出現明顯升高[28]。此外，在對乙酰氨基酚引起的肝損傷大鼠模型中，GLDH被證明是比GPT更靈敏的DILI生物標志物[29]。

2.4 穩定性

GLDH的穩定性表現在個體穩定性、藥物穩定性和檢測穩定性3個方面。在個體穩定性方面，GLDH在健康受試者血清中的濃度不受性別和年齡等因素的影響，穩定在1～10 U·L-1[30]，個體間差異小。藥物穩定性體現在GLDH不易受到藥物的抑制和誘導。某些藥物可抑制GPT的表達并掩蓋其血清水平的升高。在一項大鼠的急性肝損傷研究中發現，異煙肼和硝酸鉛會抑制GPT的表達，環丙孕酮和地塞米松會誘導GPT的表達升高，Wyeth-14643會誘導ALP的表達升高，從而導致假陽性、假陰性結果，而血清GLDH的水平不受這些藥物的影響[10]。檢測穩定性體現在人血清中GLDH在室溫下放置48 h，-20℃冷藏14 d或-80℃冷凍18個月后其水平僅輕微下降。且將3種GLDH含量不同的人血清在-80℃冷凍并融化4次后，在每個解凍循環后檢測的樣品中的GLDH濃度均在真實值的86%～103%范圍內[31]。

3 GLDH與其他新型DlLl標志物比較

由于傳統生物標志物存在的不足，除GLDH外，還出現了其他一些潛在的新型生物標志物，如：miR-122、HMGB1和OPN、細胞死亡標志物細胞角蛋白 18（cytokeratin 18 protein，CK18）等。miR-122是肝組織中含量最高的微RNA，在成年小鼠肝組織中占70%，在人肝組織中占52%[32]，在肝損傷時會釋放到血液循環中。miR-122的肝損傷特異性比GLDH更強，但其個體間的差異大，穩定性比GLDH差[13]。HMGB1是一種核內蛋白，其血清水平升高提示細胞損傷或炎癥反應，在肝損傷中比傳統生物標志物升高更早[32]。然而HMGB1在淋巴、腦和肝等組織中均廣泛大量分布從而缺乏肝特異性，且其個體內的差異大，特異性和敏感性均比GLDH差[33]。CK18是一種細胞死亡的標志物，可作為早期檢測肝細胞壞死和凋亡的標志物。OPN是一種多功能蛋白，其血清水平與肝損傷程度相關。與GLDH相比，CK18和OPN對不良預后具有更強的診斷力，但它們同樣在體內廣泛分布，缺乏肝損傷特異性[34-35]。GLDH還具有檢測方法簡便的優勢。目前GLDH采用速率法來檢測其活性。樣本中的GLDH在還原型輔酶Ⅰ（NADH）存在下催化α-酮戊二酸與氨反應生成L-谷氨酸和水，同時NADH被氧化，氧化速率與GLDH的活性成正相關，NADH在340 nm處有吸收峰，通過監測340 nm處吸光度的下降速率即可計算出樣本中GLDH活性[36]。根據這個原理，GLDH的活性測定可采用全自動生化分析儀來完成。該法操作簡便，技術成熟，而其他新型生物標志物檢測方法復雜、繁瑣，技術含量高。總之，GLDH與其他新型生物標志物相比，在肝特異性和靈敏度，個體間和個體內穩定性，檢測方法等方面的綜合能力更具優勢。

4 問題與展望

GLDH比肝損傷傳統生物標志物特異性更強、靈敏性更高、穩定性更好。與其他新型生物標志物相比較，GLDH比miR-122的個體間和個體內差異小，比HMGB1，OPN和CK18的肝損傷特異性和靈敏性更好。此外，GLDH比這些新型生物標志物更易于檢測。GLDH作為DILI的潛在循環生物標志物顯示出很大的應用潛力，具有很好的臨床應用前景。但GLDH作為DILI潛在生物標志物存在以下不足：①血清中GLDH水平的升高不一定能真實反映臨床意義上的DILI。2014年，Singhal等[37]研究發現，服用消膽胺的67名受試者中有11名受試者未引起DILI，但血清GLDH有升高的現象，其平均水平升高了7.3倍。2012年，Harrill等[38]研究發現，使用肝素的48名健康志愿者中有4例未引起DILI，但出現血清GLDH異常的現象，升高水平在4～14倍。以上研究中，GPT，HMGB1和miR-122的血清水平也存在異常升高現象。②由于GLDH主要存在于線粒體基質中，所以僅在涉及線粒體損傷的DILI時才會釋放GLDH到血液中。但隨著對DILI的機制的進一步認識，未來也許能利用GLDH與其他生物標志物聯合檢測的方式來克服其缺點，從而提高診斷的準確性，應用于臨床。

未來，GLDH將主要用于以下幾個方面：①聯合傳統或其他新型DILI標志物作為新的DILI標志物。大量研究證實，每個生物標志物都只能反映肝的某一方面的功能，不能代表肝功能的整體變化，因此在診斷肝損傷時不能單獨用一個生物標志物，應聯合檢測優勢互補的生物標志物。如GLDH作為線粒體損傷標志物可與氧化應激、細胞壞死凋亡或炎癥標志物進行聯合檢測，更準確地診斷DILI，為臨床治療提供科學參考。②用于研究DILI的相關機制。GLDH作為線粒體損傷標志物能反映線粒體的損傷情況，以進一步了解到線粒體功能障礙在DILI中的作用，對不同藥物引起的DILI機制研究有重大意義。③作為DILI治療后恢復程度判定指標。GLDH的血清水平與肝損傷程度呈正相關，患者病情加重時則GLDH血清水平升高。GLDH的半衰期較短，可實時反映肝損傷和恢復的情況。