衰老個體骨骼肌衛星細胞的研究進展

陳昱圻 郭昌龍 袁國紅 高建恩 馬旭，2

(1國家衛生健康委員會科學技術研究所 國家人類遺傳資源中心，北京 100081；2北京協和醫學院研究生院)

骨骼肌是由單核成肌細胞融合而成的多核肌纖維組成，肌纖維組織通過收縮產生力量和運動。骨骼肌中含有大量處于靜息狀態的肌源性干細胞(MDSCs)，位于肌纖維質膜和基底膜之間，被稱為衛星細胞，這些細胞對于骨骼肌的再生能力至關重要〔1〕。一旦機體發生損傷，衛星細胞就會停止靜息狀態，開始增殖，并產生大量肌源性祖細胞，這些祖細胞進一步參與肌源性活動，生成新的肌纖維并取代受損的組織〔2〕。肌纖維的生長、穩態和修復都依賴于衛星細胞，該細胞獨特的生長環境使衛星細胞池得以維持，滿足骨骼肌功能和修復的需求，但這種肌再生能力在很大程度上受衰老程度的影響，由于衰老機體局部環境發生改變引起骨骼肌功能減弱甚至喪失。

隨著人口老齡化發展，在65歲以上的人群中高度流行一種進行性、廣泛性的骨骼肌疾病，稱為骨骼肌減少癥〔3，4〕。臨床表現為肌肉質量和功能的加速喪失，導致骨骼肌功能下降，發展到衰弱階段還會導致跌倒，甚至死亡等不良后果〔3〕，伴隨骨骼肌的衰老，其衛星細胞庫的規模也在縮小，僅有一小部分衛星細胞在骨骼肌肉中存活到高齡。然而，即使其存在，這些衛星細胞也有功能缺陷，破壞了維持肌肉再生的能力。衛星細胞數量的下降發生在肌肉衰老的早期階段，由于其微環境的變化和細胞自身內在的改變共同干擾了細胞靜止、增殖和凋亡之間的平衡〔5〕。

近幾年，肌少癥已經成為研究的熱點，但肌少癥的發病機制復雜，至今仍不明確，盡管自衛星細胞發現以來取得了顯著的進展，但研究人員仍在尋找具有產肌能力的替代細胞或藥物，從而使患者得到更好的診斷和治療，為骨骼肌減少癥治療發展提供更好的途徑。

1 骨骼肌衛星細胞

1.1骨骼肌衛星細胞的定義 衛星細胞在許多脊椎動物物種中也均有發現〔2〕。1961年，Muaor〔6〕首次從青蛙骨骼肌纖維中分離出來，由于這類細胞位置及排列方式好似肌纖維的衛星，因而得名肌衛星細胞。由于衛星細胞不僅能產生分化的子代，還能通過自我更新來維持自身的種群，故可將其歸類為MDSCs。

1.2骨骼肌衛星細胞的標記和識別 在成人骨骼肌中，幾乎大部分的衛星細胞都表達成對結構域轉錄因子Pax7〔7〕和Pax3〔6〕，肌源調節因子Myf5〔8,9〕，同源盒轉錄因子Barx2〔10〕，細胞黏連蛋白M-cadherin〔11〕、核纖層蛋白(Lamin A/C)和核骨架蛋白(Emerin)〔12〕、受體酪氨酸激酶c-Met〔13〕、NCAM〔14〕、細胞表面附著受體a7-Intergin〔12，15〕、CD34〔9〕、跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Syndecan)-3和 Syndecan-4〔14，16〕，趨化因子受體CXCR4〔17〕等，但其中最典型且應用最廣泛的標志物還是Pax7。

根據不同的基因表達模式，可以將衛星細胞子代與其靜止祖細胞區分開來〔1，2〕，靜止的衛星細胞通常表達Pax7，從衛星細胞被激活到增殖階段均共表達Pax7和成肌分化蛋白(MyoD)〔7，18〕，當細胞進入分化階段時，Pax7表達下降，肌原蛋白標志物肌細胞生成素(Myogenin)表達上調。Day等〔19〕于2007年提出了一種基于Nestin基因調控元件驅動的GFP表達的衛星細胞定位、分離和基因表達分析的新方法。巢蛋白-綠色熒光蛋白(Nestin-GFP)轉基因小鼠即由Nestin基因的調控元件驅動GFP表達，最初是為了追蹤神經干細胞而開發的，但隨后的研究發現衛星細胞在所有檢測的肌肉群中都有很強的GFP表達。該特性使得衛星細胞在新分離的肌纖維中即可檢測到，但Nestin-GFP的表達在衛星細胞激活后下降，在肌原細胞培養后期通過非增殖的Pax7陽性細胞后代重新獲得。這種表達模式的動態變化反映了衛星細胞自我更新的周期。

1.3骨骼肌衛星細胞的異質性 研究發現，衛星細胞存在功能異質性，其并非都具有干細胞特征，在衛星細胞庫中存在不同的群體，來自不同肌肉的衛星細胞不僅在增殖率、克隆能力、分化程度和速率、自我更新能力等方面表現出異質性，而且在同一肌肉的衛星細胞之間也存在這些差異，且各群體中的衛星細胞均對肌再生能力有一定的影響。Marg等〔20〕在移植研究中發現在骨骼肌衛星細胞群體中，尚存在一種Pax7陰性的人肌源性細胞集落，同樣具有很高的肌再生潛力，且對肌源性標志物結蛋白(Desmin)和Myf5呈陽性，將該細胞移植到小鼠體內后，移植的Pax7陰性細胞重新填充了衛星細胞的生態位，并重新表達Pax7。

2 老年個體中肌衛星細胞的特點

老年肌肉是典型的衰老組織，其特征是脂肪組織浸潤、組織纖維化、毛細血管擴張減少及慢性炎癥的產生。這些變化將導致肌纖維的大小和數量逐漸減少，被認為是肌肉質量、橫截面積和力量逐漸減少的主要原因，這種現象被稱為肌肉減少癥〔3〕。

衛星細胞對骨骼肌的穩態和再生是至關重要的，在衰老過程中，骨骼肌逐漸減少，肌力和耐力下降，甚至發生肌肉萎縮，這些現象均與衛星細胞數量有一定關系，Fry等〔21〕利用Pax7CreER-DTA 轉基因模型小鼠模擬骨骼肌衛星細胞耗盡的狀態，證實在衛星細胞減少情況下，確實會對肌再生能力產生影響，但不會加速或加劇肌少癥，衛星細胞在衰老過程中對維持肌肉大小或纖維類型組成有一定作用，且細胞外基質的增加表明隨年齡增長，衛星細胞的丟失可能導致纖維化。

3 導致衰老機體骨骼肌衛星細胞變化的因素

老年骨骼肌再生功能的下降與衛星細胞功能的改變密切相關。從數量上看，老年個體骨骼肌中衛星細胞池數量明顯下降，從功能上看，來源于老年供體的肌衛星細胞增殖、分化形成成熟肌纖維的能力存在顯著缺陷，與年輕個體相比，老年個體衛星細胞會延遲進入活化期，且活化標志物明顯減少。肌衛星細胞的分化能力也隨年齡增長有明顯下降。老年機體的肌衛星細胞融合指數下降，限制了肌管融合形成肌纖維的過程，且在老化過程中，肌衛星細胞的異質性也在增加。

3.1宿主微環境對衛星細胞的影響 肌衛星細胞外環境包括肌纖維外多種類型的細胞和細胞外基質，通過分泌營養因子、細胞因子及細胞間相互作用影響肌肉再生。在衰老過程中細胞外環境改變可影響衛星細胞的功能及增殖分化能力，已有實驗通過將衰老的細胞移植至年輕的環境，使細胞的增殖分化能力得到恢復。Zhou等〔22〕通過從年輕供體大鼠肌肉前體細胞(YMPCs)和成年供體大鼠肌肉前體細胞(AMPCs)中提取熒光標記的MPCs分別移植到年輕、成年和老年大鼠的脛骨前肌中，從而研究年齡對移植后MPC存活、分化和組織再生的差異影響，結果表明，YMPCs在成熟肌纖維中的整合和成熟取決于宿主微環境的年齡；而AMPCs的整合和成熟較少依賴于年齡，更多依賴于細胞的內在變化。這些數據表明，宿主微環境和移植細胞的年齡在細胞治療中至關重要。

3.2線粒體功能受損對衛星細胞的影響 隨著年齡的增長，骨骼肌中線粒體活性氧的產生增加，導致與年齡相關的肌肉質量和功能的喪失。對大鼠和非人靈長類動物的研究表明，線粒體DNA (mtDNA)的突變和缺失在老化的骨骼肌纖維中明顯增加，而這些突變在肌少癥易感者的肌肉中更為常見，在骨骼肌中，線粒體DNA缺失突變可能是肌肉萎縮和功能活動下降的一種機制。Wang等〔23〕利用一種線粒體DNA雙鏈斷裂(DSBs)轉基因小鼠模型，研究了線粒體DNA損傷在肌肉萎縮中的作用，發現線粒體DNA短暫的、系統的雙鏈斷裂將導致小鼠晚年肌肉萎縮，運動能力下降，且隨著年齡的增長，衛星細胞數量明顯減少，肌肉再生及修復的能力都明顯下降。因此，系統性線粒體功能受損可能會優先影響衛星細胞庫，從而導致肌肉質量下降，最終導致肌少癥的發生。

3.3免疫系統對衛星細胞的影響 免疫系統的衰老通過多種機制對肌肉衰老和肌少癥起著重要的調節作用，包括對衛星細胞增殖和表型轉換的調節，尤其是巨噬細胞，在調節肌肉生長和再生方面具有重要作用。此外，在衰老過程中，免疫系統的功能也會發生變化，這表明在衰老過程中，肌肉細胞和免疫系統之間的調節相互作用也會發生變化，且免疫系統的老化足以引起衛星細胞數量的減少，并使衛星細胞向纖維形成表型轉變。

慢性炎癥因子被認為是衰老和老年性疾病的潛在機制，可能是正常衰老和老年性病理過程之間的橋梁〔24〕，與年齡相關的細胞內氧化還原平衡的破壞似乎是導致慢性低度炎癥的主要原因。在老年人中，炎性細胞因子升高，可能會抑制衛星細胞的分化，從而導致肌肉質量下降，肌肉力量緩慢而漸進的喪失，隨后導致肌少癥。

有數據表明，在衰老過程中促炎因子〔如腫瘤壞死因子(TNF)-a、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、環氧化酶(COX)-2、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)〕將持續上調，因為年齡相關的氧化還原失衡激活了許多促炎信號通路，包括核因子(NF)-κB信號通路。在老年骨骼肌的氧化應激和慢性炎癥過程中，一些主要的信號通路被激活或失活。這些途徑與蛋白質合成分解失衡、線粒體功能障礙及細胞凋亡有關，將導致纖維萎縮和纖維損失〔25〕。

Wang等〔26〕在一組實驗中將年齡不匹配的供體和受體小鼠進行骨髓移植，以測試免疫系統年齡對肌肉老化的影響，他們將年輕的骨髓細胞移植到年老的受者體內，則肌肉纖維表型改變的情況得以改善。將老的骨髓細胞移植到年輕的動物體內，衛星細胞的數量有所減少，衛星細胞向纖維形成表型轉變，證明年輕骨髓細胞釋放的因子在體外更有利于肌管的分化。

3.4Notch信號通路對衛星細胞的影響 Notch信號通路是大多數多細胞生物中高度保守的細胞信號系統〔27〕。Notch信號在胚胎和成體發育過程中，對增殖、干細胞維持和分化等許多基本細胞過程的調控中起著關鍵作用。Notch信號通路包含Notchl、Notch2、Notch3、Notch4四種受體和Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1、Jagged2五種配體〔26〕。

Carey等〔28〕在實驗中發現與年輕男性(18～25歲) 相比，老年男性(60～75歲) 肌肉活檢中Notch1、Jagged1、Numb和Delta-like1的表達明顯降低，這表明Notch可調節因年齡增長而受損的肌肉質量。

Aoyama等〔29〕對受傷肌肉進行分析，結果顯示，隨著年齡的增長，衛星細胞祖細胞的增殖和產生肌再生所需的成肌細胞的能力明顯減弱，是由于Delta上調信號不足，導致對Notch1的激活信號減弱，從而喪失骨骼肌再生潛能，因此，Notch信號是肌肉再生潛能隨年齡下降的決定因素。Notch信號通過與Syndecan3協同調控衛星細胞的靜息和增殖，并通過與Wnt/β-catenin信號影響細胞的不對稱分裂，從而發揮關鍵作用〔28〕。

3.5Wnt信號通路對衛星細胞的影響 Wnt 信號通路是一種古老的、進化上保守的通路〔30〕，研究發現在許多物種的胚胎發生過程中，Wnt 信號通路可以調節細胞增殖、命運和運動〔31〕。

Dhoot等〔32〕曾在實驗中證明衰老肌肉中QSulf1酶可以激活Wnt信號通路，從而調節肌肉的發育和再生。Patel等〔33〕使用Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt6和Wnt7a配體的抗體對28月齡的腓腸肌和6月齡的腓腸肌Wnt信號的激活進行比較，實驗結果表明這些配體水平在28月齡的老年肌肉中均有升高，Wnt配體均被激活。

Brack等〔34〕在研究中發現老年小鼠的肌肉干細胞(衛星細胞)在開始增殖時，傾向于從肌原性向纖維原性轉變，而這種轉變被證實與衰老肌原細胞中典型Wnt信號通路的激活有關，并且可以被Wnt抑制劑抑制，由此判斷Wnt信號通路在肌肉干細胞的衰老和伴隨衰老的組織纖維化的增加方面發揮關鍵作用〔35〕。

4 延緩肌衛星細胞衰老、改善衰老肌肉功能手段的研究

目前，肌衛星細胞抗衰老的研究主要集中在：骨骼肌衛星細胞的移植、間充質干細胞的移植、誘導多能干細胞的干預及抗衰老藥物和抗衰老因子的干預和治療等。

4.1干細胞的干預和治療

4.1.1骨骼肌衛星細胞 Ishii等〔36〕在研究中發現骨骼肌衛星細胞可以在靜止或激活狀態下被分離出來，在移植到宿主體內后，這些細胞將重新填充衛星細胞的生態位，參與未來的再生過程，實現自我更新。衛星細胞在修復肌肉方面非常有效，單個纖維上的一小部分移植的衛星細胞，甚至是通過熒光激活細胞分選得到的單個衛星細胞，都可以產生幾千個肌核。 Feige等〔37〕已建立起一套可靠的方案用于肌肉干細胞的分離及移植，并有效測定干預對體內肌肉干細胞增殖或分化的直接影響，該方法已被用于研究肌肉干細胞群的異質性和治療干預對分離干細胞群的療效〔38〕。Hall等〔39〕證明與肌肉纖維相關的衛星細胞的移植，加上誘發的肌肉損傷，顯著改變了年輕的成年宿主肌肉的環境，導致肌肉質量、干細胞數量和力的產生幾乎終身增強。

4.1.2MDSCs 在骨骼肌的損傷、修復和維持中起重要作用的單能干細胞除了衛星細胞外還有具有多向分化潛能的MDSCs，可分化成為成纖維細胞或腱細胞，在肌腱連接和肌肉相關肌腱損傷的修復中起著重要作用，因而MDSCs移植對肌損傷的修復具有很大的潛力。Parker等〔40〕通過在細胞培養板中包被Delta-1ext-IgG，以激活Notch信號通路以避免由于體外培養引起的細胞移植潛能降低的方式，建立了一套體外擴增MDSCs的方法，并獲得了足夠數量的細胞進行有效地肌肉移植，最終使移植的纖維數量顯著增加，提高了成肌細胞的移植水平，促進肌肉再生。

4.1.3間充質干細胞 非肌原性來源的細胞對肌肉再生同樣有益，來自骨髓或脂肪組織的間充質基質細胞可以通過旁分泌信號或免疫調節來刺激再生〔40〕。Maeda等〔41〕給肌營養不良小鼠移植骨髓間充質干細胞，從骨髓間充質干細胞移植小鼠中分離出的單個肌纖維與非移植小鼠的肌纖維相比，肌纖維分裂明顯減少，說明移植顯著改善了異常再生，且移植模型小鼠較非移植模型小鼠衛星細胞數量有明顯增加，證明骨髓間充質干細胞對小鼠肌肉再生有促進作用。Wang等〔42〕的實驗中為老年雄性C57BL/6J小鼠移植人臍帶沃頓膠間充質干細胞，之后通過對小鼠全身肌力、耐力、腓腸肌質量、肌肉橫截面積及炎癥因子等多方面比較，證實移植間充質干細胞后，機體內骨骼肌衛星細胞被激活，減少細胞凋亡的比例及骨骼肌慢性炎癥的發生〔43〕。

4.1.4誘導多能干細胞(iPSCs) 誘導iPSCs技術可以使成年體細胞重新編程，并使其隨后向肌源性譜系發展，因而有學者嘗試研究利用iPSCs誘導的肌原性祖細胞進行細胞移植進行相關疾病治療的可能性〔44〕。Pax3/Pax7在分化PSCs中的條件表達使肌源性祖細胞的再生能力增強，且實驗證明體外生成的iPSCs(衍生的肌源性祖細胞)中具有類似于胚胎肌母細胞的分子特征。然而，與胎兒成肌細胞相比，移植后其表現出更好的肌纖維植入和種子衛星細胞生態位的能力，Pax3/pax7誘導的肌源性前體細胞iMPCs移植到成年肌肉環境后，其分子特征發生改變，功能成熟。

Rao等〔45〕通過在從hPSCs分化的近軸中胚層細胞中瞬時過表達Pax7來獲得誘導的iMPCs，且在優化的三維培養條件下，來自多個hPSC系的iMPCs可再生地形成功能骨骼肌組織，其中包含排列整齊的多核肌管，當移植到免疫缺陷小鼠的后肢肌肉時，骨骼肌組織逐漸血管化并維持功能〔42〕。

4.2抗衰老藥物及其他干預和治療

4.2.1Sirt1的干預作用 Sirt1是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，與長壽有關，具有抗衰老的作用。骨骼肌修復依賴于衛星細胞，衛星細胞功能隨年齡增長而減弱，Sirt1過表達會增加老年小鼠肌肉修復和肌肉功能〔45〕。且有研究認為Sirt1是骨骼肌基因表達的重要代謝調節因子〔46〕，當Sirt1活性升高則可以促進衛星細胞的增殖。

Myers等〔46〕在實驗中證實敲除衛星細胞Sirt1基因的小鼠，其腓腸肌和比目魚肌雖然沒有明顯縮小，但其足底彎曲力明顯下降，且肌肉功能也受到了影響。由此證明，衛星細胞中Sirt1的表達對骨骼肌功能發育和肌再生都具有重要意義〔47〕。

4.2.2白藜蘆醇的干預治療 白藜蘆醇是一種主要存在于葡萄中的多酚化合物。據報道，白藜蘆醇具有抗氧化，延長生命及能量代謝調節作用〔48〕。研究發現，白藜蘆醇可以通過激活Sirt1，進而調節其下游因子的表達與活性，發揮抗氧化、抗炎癥與抑凋亡等作用。Danz等〔49〕研究發現白藜蘆醇通過改變線粒體功能，激活 Sirt1通路來防止氧化應激。另外，白藜蘆醇通過增強 Sirt1表達進而增加胰島素抵抗大鼠原代脂肪細胞的葡萄糖消耗和超氧化物歧化酶(SOD)含量，抑制丙二醛(MDA)的產生。

白藜蘆醇作為Sirt1的激活劑，被證實在老年大鼠后肢懸吊后恢復期使用可對后肢肌肉的衛星細胞增殖有改善作用〔50〕，白藜蘆醇可以降低ROS水平，防止激活的衛星細胞在壓力下數量和功能喪失，對靜止的衛星細胞也有一定影響。

4.2.3Senolytics類藥物的藥物干預治療 隨著年齡的增長，許多組織、慢性疾病相關的器官中衰老細胞會逐漸增多，且衰老細胞會持續存在，因為它們會分泌許多促炎和組織重塑分子，所以會對周圍細胞產生毒性。通過轉錄分析，研究人員發現，與癌細胞一樣，衰老細胞增加了“促生存網絡”的表達，從而幫助其抵抗細胞凋亡或程序性細胞死亡。

Senolytics是一類選擇性殺傷衰老細胞的藥物，直到現在，已報道的Senolytics藥物有7類，包括激酶抑制劑、B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2家族抑制劑，天然化合物，p53結合抑制劑，HSP90抑制劑，UBX0101，和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。最近，達沙替尼和槲皮素的聯合應用的研究被報道，研究表明達沙替尼和槲皮素能夠選擇性地誘導衰老細胞死亡〔35，51〕。其中，達沙替尼可清除衰老的人脂肪細胞祖細胞，而槲皮素對衰老的人內皮細胞和小鼠骨髓干細胞的殺傷作用更強〔35〕。當兩種化合物聯合使用時，清除衰老細胞的功效是最強的，可增強老齡小鼠的生理功能，延長健康壽命和壽命。

5 面臨的問題及未來研究方向

衰老期肌衛星細胞的增殖分化受到多種因素調控，細胞因子和信號通路的作用、氧化應激和骨骼肌分子炎癥的作用將有利于加深對骨骼肌衰老的認識，幫助我們更好地了解肌少癥的病因和進展，為臨床運用提供理論基礎，為老年或老年病造成的肌少癥等疾病提供新的治療思路〔52，53〕。如將細胞因子和干細胞移植相結合，兩種方式同時進行干預，改變老年肌源性祖細胞的生長環境，將有效促進骨骼肌再生，使肌少癥患者的臨床癥狀得到有效緩解。

由于肌少癥病因復雜，尋找真正有效可行的治療策略可能還需要結合多學科，進行更深入的研究。目前國內外已開展多項干細胞治療，通過干細胞的植入，促進肌肉損傷修復和再生，改善潛在的肌肉骨骼疾病〔54，55〕。干細胞的移植效率及移植后骨骼肌再生能力的改善則成為治療后需要關注的重要問題。以細胞為基礎的治療肌肉再生障礙的最佳療法應該是提供一個靜止的衛星細胞池，以確保維持和再生〔18，56〕。

綜上，通過大量研究證實，隨著年齡增長，骨骼肌逐漸減少，肌力和耐力下降等癥狀均與衛星細胞數量有關系，且受機體微環境等因素所影響，衰老相關的肌衛星細胞的研究已經很多，也趨于成熟，取得了一定積極的成果，但如將這些方法應用于臨床則仍有很大改善空間，研究人員仍需尋找有產肌能力的替代細胞或藥物方面進行深入的探索研究，從而使患者得到更好的診斷和治療。