繡球菌水提物的免疫促進作用

呂國英，王富根，李云濤，張作法*

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千島秀菇生物科技有限公司，浙江 淳安 311701；3.常山豪鋒農業開發有限公司，浙江 常山 324200)

繡球菌隸屬于擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、繡球菌科，是一種珍稀的特色食藥用菌。繡球菌口感脆嫩清香，含有豐富的營養物質，被稱為“萬菇之王”。繡球菌富含β-葡聚糖，據報道，繡球菌中葡聚糖含量達到47.7%[1]。另外氨基酸種類齊全，其中以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量較高。另外，繡球菌中含有豐富的維生素，其中VB3和VE含量居菌藻類食物前列[2]。

豐富的營養物質賦予了繡球菌卓越的藥理活性，據報道繡球菌在抗腫瘤[3]、降血糖[4]、保護神經[5]、保護腸胃[6]及美容[7]方面具有很好的藥理作用。目前，繡球菌在我國主要作為食材，相關功能產品的種類很少，本實驗通過研究繡球菌提取物的免疫促進作用，為其深加工產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

繡球菌水提物，由杭州千島湖頗益農產品專業合作社聯合社提供；臨用前以飲用水配成相應濃度(7.5、15和30 mg·mL-1)，按20 mL·kg-1灌胃給藥。人參水煎液的制備：生曬參(華東醫藥股份有限公司)，粉碎后加10倍量水，浸泡30 min，煎煮提取1 h，濾過，濾渣加8倍量水，煎煮提取0.5 h，濾過，濾渣加6倍量水，煎煮提取0.5 h，濾過，合并濾液，水浴濃縮至生藥含量為0.1 g·mL-1的人參水煎液，4～8 ℃冷藏保存，作為免疫試驗的陽性對照用藥。

環磷酰胺針(安道生)，規格為每支0.2 g(批號7F174A，德國Baxter Oncology GmbH)，臨用時用生理鹽水稀釋。噻唑藍(MTT，ST316)購自碧云天；刀豆蛋白ConA購自Solarbio公司(C8110)；RPMI1640培養基購自Gibco公司(8117008)；胎牛血清購自四季青；紅細胞裂解液為自配(配方：NH4Cl 0.373 5 g，Tris 0.13 g，溶于50 mL雙蒸水，0.22 μm過濾除菌后使用)。

1.2 動物及飼養環境

ICR雄性小鼠，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。飼養于浙江省農業科學院動物房(清潔級)，溫度18～24 ℃，相對濕度60%～80%，全價顆粒飼料來源于浙江省實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1 對非特異性免疫功能方面的影響

雄性ICR小鼠60只，體重18～22 g，適應性喂養3 d后，隨機分為正常對照、模型對照、陽性對照組(人參水提液2.0 g·kg-1)、繡球菌水提物3個劑量組(150、300和600 mg·kg-1)，每組10只，分別灌胃給予相應藥物，每天1次，連續15 d，給藥容積均為20 mL·kg-1體重，對照組給予等容積蒸餾水，給藥第11 d除正常對照組外均皮下按0.01 mL·g-1劑量注射環磷酰胺50 mg·kg-1，每天1次，連續4 d，末次給藥后1 h尾靜脈按0.01 mL·g-1劑量注射1∶4稀釋的墨汁，注射2 min和10 min后于小鼠左右眶后靜脈取血20 μL，置于預先盛有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中混勻，取0.1 mL于96孔板在600 nm處測定吸光度(OD)；同時取小鼠胸腺、脾臟、肝臟稱重，以每1 g小鼠的脾重和胸腺重作為脾指數和胸腺指數，并計算K值和吞噬指數。

1.3.2 對細胞免疫功能的影響

取雄性ICR小鼠5只，體重18～22 g，適應性喂養3 d后，脫頸椎處死，75%乙醇滅菌后無菌解剖，取脾臟裝于含PBS的培養皿中，以5 mL注射塞碾磨后混勻，200目滅菌雙層尼龍篩過濾。合并濾液，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，彈勻后加少量破紅裂解液，以PBS中和破紅，1 500 r·min-1離心5 min后棄上清，以含10% FBS的RPMI 1640培養液輕輕吹打重懸沉淀，采用流式進行活細胞計數。用于增殖實驗測定。

增殖實驗：調整小鼠脾細胞為1×107個·mL-1，每孔100 μL種板于96孔中。設立空白組、正常對照組、ConA組、繡球菌水提物各劑量組、繡球菌水提物各劑量聯合ConA組，每孔加入藥物100 μL，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養44 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL繼續培養4 h。2 000 r·min-1離心5 min，以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育20 min，490 nm測定OD值，計算增殖指數。

1.4 統計方法

所有計量數據均表示為X±SD，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，計數數據采用q檢驗。

2 結果與分析

2.1 對非特異性免疫功能方面的影響

與正常組相比，環磷酰胺注射后小鼠體重下降，其中模型組具有統計學差異(表1)。與模型組相比，各給藥組和陽性組吞噬指數升高，其中繡球菌水提物300和600 mg·kg-1處理組具有統計學差異。

表1 繡球菌水提物對小鼠碳廓清試驗的影響

與正常組相比，模型組肝臟系數有增加，各組均無顯著差異，但各組脾臟和胸腺系數極顯著下降

(表2)。與模型組相比，繡球菌水提物300和600 mg·kg-1處理組和陽性組胸腺系數呈增加趨勢，其中陽性組與模型組有顯著差異。與模型組相比，繡球菌水提物各處理組和陽性組脾臟指數升高，其中繡球菌水提物300 mg·kg-1處理組和陽性組具有統計學差異，表明繡球菌水提物能夠促進胸腺和脾細胞的增殖，增強巨噬細胞的吞噬功能。

表2 繡球菌水提物對小鼠臟器指數的影響

2.2 對細胞免疫功能的影響

如表3所示，單獨給藥時，繡球菌水提物0.4和0.8 mg·mL-1具有促淋巴細胞增殖趨勢，但無統計學差異，當濃度達到1.6和3.2 mg·mL-1時呈現抑制淋巴細胞增殖趨勢，尤其濃度為3.2 mg·mL-1時具有統計學顯著差異。ConA(5 μg·mL-1)單獨處理組對小鼠淋巴細胞增殖有一定的促進作用，與正常組相比具有統計學差異。聯合給藥時，繡球菌水提物各劑量組刺激脾淋巴細胞增殖程度均較單獨給藥時有顯著升高，尤其在0.4和0.8 mg·mL-1劑量下與ConA有協同促進作用，具有統計學意義，當濃度升高到1.6 mg·mL-1時，較ConA(5 μg·mL-1)單獨處理組無明顯差異，當濃度達3.2 mg·mL-1時，呈現抑制淋巴細胞增殖作用。本試驗條件下，繡球菌水提物具有一定的免疫功能促進作用。

表3 繡球菌水提物對小鼠淋巴細胞體外增殖活性的影響

3 討論

目前已經有多個關于繡球菌多糖在提高免疫力方面的報道，謝添等[8]的研究發現，繡球菌多糖能夠促進巨噬細胞RAW264.7的增殖，具有潛在的免疫調節作用，這可能與其通過細胞表面受體TLR4激活信號轉導通路，增強下游細胞因子的釋放來調節巨噬細胞的免疫功能有關[9]。郝晨陽等[10]的研究發現，繡球菌多糖對免疫低下小鼠腸道免疫功能具有很好的調節作用。張迪等[11]也報道了繡球菌多糖具有促進大鼠脾淋巴細胞體外增殖的免疫活性。因此，在本研究中繡球菌水提物對環磷酰胺誘導小鼠免疫下降具有保護作用，可增強巨噬細胞的吞噬功能，同時對小鼠淋巴細胞增殖有一定的促進作用，這些免疫促進活性可能與水提物中的多糖有關。