辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜及含量測定研究

李振雨，呂渭升，何民友，段志文，楊潔，劉曉霞，魏梅，2，孫冬梅，2，陳向東

1.廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244；2.江西一方天江藥業有限公司，江西 南昌 330006

辛夷為木蘭科植物望春花Magno1ia biondiiPamp.、玉蘭Magno1ia denudataDesr.或武當玉蘭Magno1ia sprengeriPamp.的干燥花蕾，具有散風寒、通鼻竅作用，用于治療風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵[1]。辛夷始載于《神農本草經》，列為上品，歷代本草均有收載。現代化學和藥理學研究表明，辛夷主要含有揮發油、木脂素、黃酮、生物堿等有效成分，具有抗炎、抗過敏、降壓、興奮子宮等藥理作用，臨床多用于治療鼻炎和鼻竇炎等[2-4]。

傳統中藥飲片臨床使用以湯劑為主，湯劑的活性成分是中藥臨床有效性的物質基礎，辛夷配方顆粒以水為溶劑，經現代工業提取、濃縮、干燥、制粒而制成，作為新的飲片形式代替傳統飲片供臨床辨證論治、隨證加減、配方使用[5]。目前辛夷配方顆粒的質量控制模式仍延續傳統的化學藥品質量控制思路，僅以木蘭脂素為定量指標[6-8]，然而以木蘭脂素為代表的木脂素類有效成分極性較小、水溶性差，因此，該類化學成分從飲片到配方顆粒的轉移率并不高，僅測定木蘭脂素等木脂素類成分對辛夷配方顆粒生產工藝的質量控制略顯不足；另外，單一化學成分定量分析難以全面反映配方顆粒的內在質量，且缺乏專屬性。中藥色譜指紋圖譜能夠提供更為全面、豐富的定性和半定量信息。HPLC指紋圖譜因柱效低、色譜分離能力有限、分析時間長等缺點，難以適應中藥復雜體系的研究。超高效液相色譜法（UPLC）分辨率高、分離能力強、分析時間大大縮短，在中藥指紋圖譜建立方面優勢明顯[9-10]。

本研究采用UPLC建立辛夷配方顆粒指紋圖譜，對辛夷配方顆粒有效成分進行定性和半定量分析，并增加對辛夷配方顆粒水溶性成分的定量分析，從多角度控制辛夷配方顆粒的質量，為提升辛夷配方顆粒的質量控制水平提供依據。

1 儀器與試藥

Waters H-Class超高效液相色譜儀（沃特世公司），YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），ME204E萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），XP26百萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），JJ600電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），KQ500D數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Milli-Q Direct超純水系統（默克股份有限公司）。

木蘭脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110882-201708，含量96.5%），木蘭花堿對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號wkq17063003，含量98.0%），松脂素二甲醚對照品（伊普賽諾，批號1506434，含量100.0%），表木蘭脂素B對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號wka02424，純度≥98%），辛夷對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號121079-200704）。乙醇、甲醇為分析純（西隴科學有限公司），磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）為色譜純，水為超純水（實驗室自制）。

辛夷配方顆粒10批（批號CG01～CG10），來自廣東一方制藥有限公司。制備方法：取辛夷飲片6 000 g，加水煎煮，收集揮發油適量（以β-環糊精包合，備用），過濾，濾液濃縮成清膏，加入揮發油包合物，再加入輔料適量，噴霧干燥，加入輔料適量，混勻，制粒，制成1 000 g，即得。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 超高效液相色譜條件

采用YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），以乙腈為流動相A、0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，

15%～38%A；25～35 min，38%～44%A；35～39 min，44%～100%A；39～40 min，100%A），流速0.3 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫30℃，進樣量1μL。

2.1.2 超高效液相色譜-質譜聯用條件

流動相為乙腈-0.1%甲酸，其余色譜條件同“2.1.1”項下，電噴霧離子源（H-ESI），正離子掃描模式，掃描范圍（m/z）70～1 050 Da，歸一化碰撞電壓（NCE）20 V，鞘氣壓力35 arb，輔助壓力10 arb，噴霧電壓3.80 kV，吹掃氣0 arb，0S-lens電壓50 V，毛細管溫度350℃，加熱溫度350℃。

2.1.3 對照品溶液制備

取木蘭脂素、木蘭花堿、松脂素二甲醚和表木蘭脂素B對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含木蘭脂素55μg、木蘭花堿100μg、松脂素二甲醚100μg和表木蘭脂素B 50μg的溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液制備

取辛夷配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.5 指紋圖譜方法學考察

2.1.5 .1精密度試驗

取辛夷配方顆粒（批號CG09）適量，研細，取約0.2 g，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，連續進樣6次，以5號峰木蘭脂素峰為參照峰S，計算其余共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD為0.04%～0.19%，相對峰面積RSD為0.10%～0.69%，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 .2重復性試驗

取辛夷配方顆粒（批號CG09）適量，研細，取約0.2 g，平行6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以5號峰木蘭脂素峰為參照峰S，計算其余共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD為0.06%～0.25%，相對峰面積RSD為0.14%～0.63%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 .3穩定性試驗

取辛夷配方顆粒（批號CG09）適量，研細，取約0.2 g，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以5號峰木蘭脂素峰為參照峰S，計算其余共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD為0.07%～0.24%，相對峰面積RSD為0.20%～0.51%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.6 指紋圖譜建立及分析

分別取10批辛夷配方顆粒樣品，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄各批次辛夷配方顆粒樣品指紋圖譜。將10批辛夷配方顆粒指紋圖譜的CDF格式導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012.130723版）軟件，以批號CG09樣品指紋圖譜為參照圖譜，進行共有峰標識，共標定7個共有指紋峰（見圖1），進行多點保留時間校正和峰匹配，生成辛夷配方顆粒對照指紋圖譜（見圖2）。計算10批辛夷配方顆粒樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結果見表1。

圖1 10批辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有峰標識

圖2 辛夷配方顆粒UPLC對照指紋圖譜

表1 10批辛夷配方顆粒指紋圖譜相似度評價

10批辛夷配方顆粒指紋圖譜的相似度為0.965～0.997，表明10批樣品具有較高的相似性。為嚴格控制辛夷配方顆粒的大生產質量，根據10批樣品測定結果，規定按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012.130723版）計算，辛夷配方顆粒供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應不得低于0.95。

2.1.7 指紋圖譜共有指紋峰的高分辨質譜指認

取辛夷配方顆粒（批號CG09）供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜和質譜條件進樣分析，根據高分辨質譜提供的準確分子量與辛夷配方顆粒樣品質譜圖中未知色譜峰的分子量進行對比，結合目標色譜峰的二級質譜信息，并與賽默飛mzVault標準數據庫進行匹配，對辛夷配方顆粒指紋圖譜7個共有指紋峰進行指認，共指認出其中4個成分，分別為2號峰木蘭花堿、4號峰松脂素二甲醚、5號峰木蘭脂素和7號峰表木蘭脂素B，見圖3、表2。

表2 辛夷配方顆粒指紋圖譜指紋峰鑒定

圖3 辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有指紋峰的質譜指認

2.1.8 指紋圖譜共有峰的對照品確證

根據質譜指認結果，通過對照品保留時間比對，并結合紫外-可見3D光譜圖，對高分辨質譜指認出的色譜峰進行確證，確定峰2為木蘭花堿、峰4為松脂素二甲醚、峰5為木蘭脂素、峰7為表木蘭脂素B，見圖4。

圖4 辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有峰的對照品確證

2.2 木蘭脂素和木蘭花堿含量測定

2.2.1 色譜條件

同“2.1.1”項下。

2.2.2 對照品溶液制備

取木蘭脂素和木蘭花堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木蘭脂素55μg、木蘭花堿100μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備

同“2.1.4”項下。

2.2.4 精密度試驗

取木蘭脂素、木蘭花堿對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，木蘭脂素及木蘭花堿峰面積的RSD分別為0.68%、2.6%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 線性關系考察

精密稱取木蘭脂素對照品19.462 mg、木蘭花堿對照品20.356 mg置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL含木蘭脂素1 878.083μg、木蘭花堿1 994.888μg的對照品貯備液。分別精密移取上述對照品貯備液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述6個不同濃度對照品溶液1μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。木蘭脂素回歸方程為：Y=1 871.81X+3 442.95，r=0.999 9，表明木蘭脂素在18.781～1 878.083μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。木蘭花堿回歸方程為：Y=11.899X+17.288，r=0.999 9，表明木蘭花堿在19.949～1 994.888μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2.6 重復性試驗

取辛夷配方顆粒樣品（批號CG09）適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，計算木蘭脂素和木蘭花堿的平均含量和RSD。結果顯示，木蘭脂素平均含量為22.87 mg/g，RSD=0.27%；木蘭花堿平均含量為24.62 mg/g，RSD=1.49%。RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗

分別精密稱定木蘭脂素對照品24.576 mg、木蘭花堿對照品27.719 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品加樣母液。取9個錐形瓶，分為3組，每組3個，按樣品與對照品含量為1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例分別加入木蘭脂素和木蘭花堿對照品母液各1、2、3 mL，氮氣吹干。取辛夷配方顆粒（批號CG09），研細，取約0.1 g，平行9份，精密稱定，置于上述錐形瓶中，按“2.2.3”項下確定的方法制備9份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算木蘭脂素和木蘭花堿的含量和加樣回收率。結果木蘭脂素加樣回收率為95.16%～98.32%，平均回收率為96.51%，RSD=0.86%；木蘭花堿加樣回收率為94.60%～103.19%，平均回收率為99.10%，RSD=2.80%，均符合要求，表明該方法準確度良好。結果見表3。

表3 木蘭脂素、木蘭花堿加樣回收率試驗結果

2.2.8 穩定性試驗

取辛夷配方顆粒（批號CG09）適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算木蘭脂素、木蘭花堿峰面積RSD分別為0.36%、0.24%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.9 樣品測定

按“2.2.3”項下方法制備10批辛夷配方顆粒供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，采用外標法計算辛夷配方顆粒中木蘭脂素和木蘭花堿的含量，結果見表4。

表4 10批辛夷配方顆粒中木蘭脂素和木蘭花堿含量測定結果（mg/g）

10批辛夷配方顆粒樣品木蘭脂素含量為18.65～27.87 mg/g，木蘭花堿含量為21.20～32.97 mg/g，不同批次辛夷配方顆粒木蘭脂素和木蘭花堿的含量存在一定差異。根據10批辛夷配方顆粒木蘭花堿的含量測定結果，以均值的70%為限度標準，辛夷配方顆粒木蘭脂素的含量應不低于16.96 mg/g，修約為17.0 mg/g，即每1 g配方顆粒含木蘭脂素（C23H28O7）應不低于17.0 mg；辛夷配方顆粒木蘭花堿的含量應不低于18.86 mg/g，修約為19.0 mg/g，即每1 g配方顆粒含木蘭花堿（C20H24NO4）應不低于19.0 mg。

3 討論

本試驗采用UPLC對辛夷配方顆粒指紋圖譜與有效成分的含量進行同時測定，在45 min內即完成主要色譜峰的良好分離，且230 nm處色譜峰數目較多、響應值較大、基線平穩，定量指標木蘭脂素和木蘭花堿的分離度和峰純度符合定量要求，因此選擇230 nm作為檢測波長。流動相的篩選考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3種溶劑系統的洗脫和分離效果，結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，各色譜峰出峰時間短、分離度較好。考察4種不同品牌和填料的色譜柱YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）對各色譜峰的分離效果，結果采用YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm）時各色譜峰分離效果最佳。含量測定與指紋圖譜方法一致，在保證主要色譜峰得到較好的分離情況下，縮短分析時間。

本研究對供試品溶液的制備方法進行考察，包括提取溶劑、提取方式、提取時間以及提取溶劑用量，最終確定樣品的最佳前處理方法。在提取溶劑考察中，分別考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇和水等溶劑，結果顯示，采用80%甲醇為提取溶劑，辛夷配方顆粒指紋圖譜各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值及2種有效成分的含量最大，因此，選擇80%甲醇為提取溶劑。同時比較了超聲與回流提取方式，結果顯示，2種提取方式各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值、峰型及分離效果，以及木蘭脂素和木蘭花堿的含量無明顯差異，為操作方便，選擇超聲提取的處理方式。此外，對不同超聲時間（15、30、45 min）及提取溶劑不同用量（15、25、50 mL）進行考察，以各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值及2種有效成分的含量為考察指標，優選最佳的提取時間和溶劑用量，結果顯示，采用80%甲醇25 mL超聲提取30 min的提取效率最高。

鑒于中藥有效成分的多樣性及復雜性，單一成分定量的化學藥品質量控制模式既缺乏專屬性，又難以反映中藥內在質量屬性，因此，采用指紋圖譜結果多成分含量測定的方式，實現對辛夷配方顆粒的質量控制，結果顯示，10批辛夷配方顆粒指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.95以上，表明不同批次的配方顆粒樣品相似度較高，生產工藝相對比較穩定。

2020年版《中華人民共和國藥典》辛夷項下僅以木蘭脂素為含量測定指標，難以反映辛夷配方顆粒的內在質量。本研究采用UPLC建立辛夷配方顆粒的指紋圖譜，同時測定其木蘭脂素、木蘭花堿含量，以建立的方法對10批辛夷配方顆粒的指紋圖譜相似度及木蘭脂素、木蘭花堿含量進行了比較，實現對辛夷配方顆粒中有效成分的定性和半定量分析，并增加對辛夷配方顆粒中水溶性成分的定量分析，從多角度控制辛夷配方顆粒的質量，該方法專屬性強，分析時間短，能夠有效提升辛夷配方顆粒的質量控制水平。