少精癥、弱精癥患者精漿miR-34c 的表達及意義

余亮亮 李朋

浙江省麗水市人民醫院泌尿外科，浙江麗水 323000

研究顯示，育齡期夫婦的不孕不育癥發病率約為10%～15%，其中30%是由男性因素所引起，少精癥、弱精癥是導致男性不育的主要原因[1,2]。由于精液的異質性，多數少精癥、弱精癥患者的發病機制尚不明確[3]。精子中約有90%的基因處于活躍的轉錄狀態，微小核糖核酸是一類內源性的非編碼RNA，大小約19～26 個核苷酸，參與人體多種生理過程，在精原干細胞自我更新、分裂繁殖及精子的生長發育中發揮重要作用[4]。微小核糖核酸-34c（miR-34c）是miRNAs 家族的重要成員，有研究顯示，miR-34c對正常睪丸功能、調節精子成熟和功能發揮重要作用[5]，故推測miR-34c 可能與少精癥、弱精癥患者的精液質量有一定的關系。因此，本研究通過檢測精漿miR-34c 表達水平，探討其與少精癥、弱精癥患者精液質量的關系，為臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2022 年3 月浙江省麗水市人民醫院收治的135 例少精癥患者為少精癥組，156例弱精癥患者為弱精癥組，同期選取150 例育齡期健康男性為對照組。納入標準：①少精癥組、弱精癥組患者均符合世界衛生組織相關診斷標準[6]；②年齡22～40 歲；③少精癥組、弱精癥組受試者的夫妻性生活正常且未采取避孕措施2 年以上而未能生育者；④配偶婦科檢查結果正常；⑤對照組經精液標本檢查結果正常；⑥受試者依從性好；⑦受試者均知情同意。排除標準：①泌尿生殖系統感染；②其他原因導致的男性不孕如隱睪、染色體異常、化療等；③采樣期間吸煙、酗酒等；④合并其他慢性疾病；⑤造血系統疾病；⑥精神疾病患者；⑦射精障礙者。少精癥組受試者年齡 24～40 歲，平均（33.15±6.32）歲；體質量指數21～29kg/m2，平均（25.48±2.67）kg/m2；弱精癥組受試者年齡22～39歲，平均（31.86±6.89）歲；體質量指數20～29kg/m2，平均（26.04±2.54）kg/m2；對照組受試者年齡22～40 歲，平均（32.85±5.36）歲；體質量指數22～29kg/m2，平均（25.77±2.47）kg/m2。三組受試者的年齡、體質量指數比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經浙江省麗水市人民醫院倫理委員會審核批準（批件號：201912-003）。

1.2 研究方法

1.2.1 精子樣本采集與制備 樣本采集前禁欲1 周，采用手淫法取精液于無菌取精杯中，于37℃恒溫箱中靜置30min，至完全液化后進行常規精液檢查，以1500 轉/min 離心10min，12000 轉/min 離心5min，取精漿2～3ml，-80℃保存備用。

1.2.2 常規精液質量檢查 采用RT-S100 精子質量分析儀（深圳市瑞圖生物技術有限公司）進行精液量、精子正常形態率、精子濃度、精子活力a+b 級百分比（a 級為精子運動狀況極好，呈快速直線前向運動；b 級為精子運動狀況很好，呈前向的曲線運動；a+b 級>50%為精子活力正常）及精子前向運動率檢查。

1.2.3 精漿miR-34c表達水平檢測 使用Trizol試劑盒（美國Invitrogen 公司）提取精漿總RNA，取200μl預處理的精漿樣本，加入1ml Trizol 混勻，倒入裝有氯仿、異丙醇和95%乙醇的離心管中，獲得總RNA；用cDNA 合成試劑盒（北京天根生化科技公司）進行反轉錄，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTap，使用MA-6000 實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（蘇州雅睿生物技術有限公司）進行聚合酶鏈反應，反應條件為95℃，30s；95℃，15s；60℃，60s，40 個循環。每個樣本設置3 個復孔，以焦碳酸二乙酯處理過的雙蒸水為陰性對照，以U6 為內參，各引物擴增序列見表1。

表1 引物擴增序列

1.3 觀察指標

比較三組的精漿miR-34c 表達水平、精液質量（包括精液量、精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率），并分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平與精液質量的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行處理和分析，計量資料均行正態性檢驗，符合正態分布的以均數±標準差（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗；采用Pearson 相關性分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達與精液質量的關系，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組的精漿miR-34c 表達水平比較

三組的精漿miR-34c 表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達水平均低于對照組（P<0.05），少精癥組與弱精癥組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 三組的精漿miR-34c 表達水平比較（ ）

表2 三組的精漿miR-34c 表達水平比較（ ）

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 三組的精液質量參數比較

三組的精液量比較，差異無統計學意義（P>0.05）；三組的精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率比較，差異有統計學意義（P<0.05）；少精癥組、弱精癥組的上述指標均低于對照組（P<0.05），少精癥組的精子總數、精子濃度低于弱精癥組（P<0.05），少精癥組的精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率高于弱精癥組（P<0.05），見表3。

表3 三組的精液質量參數比較（ ）

表3 三組的精液質量參數比較（ ）

注：與對照組比較，*P<0.05；與弱精癥組比較，#P<0.05

2.3 少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質量的相關性

Pearson 相關分析結果顯示，少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液量無相關性（P>0.05），與精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關（P<0.05），見表4。

表4 少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質量的相關性

2.4 弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質量的相關性

Pearson 相關分析結果顯示，弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液量無相關性（P>0.05），與精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關（P<0.05），見表5。

表5 弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質量的相關性

3 討論

少精癥、弱精癥是導致男性不育的常見原因，好發于精索靜脈曲張、內分泌異常、生殖道感染者[7,8]，其精液質量如精子總數、精子濃度、精子活力等降低，不僅影響不育者的身體健康，還帶來嚴重的心理壓力。本研究中少精癥組、弱精癥組的精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率均低于對照組，提示少精癥、弱精癥患者的精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率均低于正常水平，與于忠英等[9]的研究一致。另外，少精癥組的精子總數、精子濃度低于弱精癥組，但少精癥組的精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率高于弱精癥組，提示少精癥患者的精子總數、精子濃度更低，弱精癥患者的精子活力a+b級百分比、精子前向運動率更低。少精癥又稱作精子減少癥，主要表現為精子減少，但同時精子活力較正常水平減弱；弱精癥主要表現為精子活動力低下，但同時精子數量較正常水平減少[10-12]。

本研究結果顯示，少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達水平均低于對照組，少精癥組與弱精癥組間無明顯差異，提示少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c表達水平低于健康育齡期男性，推測miR-34c 可能參與少精癥、弱精癥的病理過程。miR-34c 是miR-34家族成員，miR-34 家族在進化中是一類保守的miRNA 家族，成熟的miR-34c 序列位于同一主基因原初轉錄本的外顯子內[13,14]。Dorostghoal等[15]研究顯示，不育者的精子miR-34c-5p 含量顯著低于可育對照者，本研究結果與之一致，證實miR-34c 與男性不育的發生密切相關[16]。

本研究進一步相關性分析miR-34c 表達水平與精漿質量的關系，結果顯示，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平與精子總數、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關，提示miR-34c 表達水平與少精癥、弱精癥患者的精液質量存在緊密聯系。王凡等[17]研究顯示，MicroRNA-34b/c 位點rs4938723 與男性不育相關。Momeni等[18]研究發現，miR-34b/c 啟動子區域的高甲基化可引起miR-34 家族異常低表達，進而影響精液質量。另有相關研究報道，miR-34c 具有相似或相同的種子序列，能夠與3’-UTR 區域結合，從而對基因表達產生影響，同時調節患者的免疫系統，在精子的生成中發揮作用[19]。Welponer等[20]研究發現，miR-34a 和miR-34b/c 的啟動子區域存在p53 結合位點，p53 能夠直接調節miR-34 家族成員的表達進而影響生精細胞的凋亡、精母細胞的分裂等過程。基于以上研究猜測miR-34c 的表達水平能夠影響精子質量，臨床可嘗試通過調控miR-34c 的表達治療少精癥、弱精癥。

綜上，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平低于正常水平，且與精液質量呈正相關，miR-34c的異常表達可能是影響少精癥、弱精癥患者精液質量的原因之一。