多元統計方法初步分析陜西產艾葉中揮發性成分特征

王春柳 萬兆新 周 潔 安玉葉 龍凱花 劉 洋 張 紅 李 曄 蘇同生

(1 陜西省中醫藥研究院，西安，710003；2 陜西省中醫醫院，西安，710003；3 陜西中醫藥大學，咸陽，712046)

艾草，又稱艾、艾葉、冰臺、艾蒿、醫草、灸草，是一種集藥品、食品、保健品和文化特征于一體的藥用植物[1-2]。最早關于艾的記載源于《詩經》中“彼采艾兮，一日不見，如三歲兮”[3]。兩千多年來，艾草一直以各種身份出現在我國人民的生活中，不僅具有傳統醫用用途，在日用品、食品、保健品中也有大量應用，市場潛力巨大。不斷增長的市場需求也對艾條和艾葉的產量及質量控制提出了更高的要求，但目前我國艾草產業發展還處于極不平衡的狀態，品牌知名度較高的湖北蘄春和河南南陽區域艾草供不應求[4-5]，全國大面積艾草種植和規模化種植分布嚴重不均，難以滿足全國驟增的市場需求。此外，艾葉及藥用艾條的質量控制目前還不完善，制約了艾草行業整體的發展水平。陜西是艾葉的眾多產區之一，本草學考證可歸于古代“北艾”產區范圍內[1，6]，在地理環境方面，陜西境內覆蓋了艾草最適宜生長的北緯33°～36°范圍[7]，非常適宜艾草生長。因此，在艾葉市場及陜西艾葉產業快速發展的推動下，積極開展艾葉的現代研究對于艾葉的質量控制具有重大意義。本文基于氣相色譜-質譜(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)聯用技術，對陜西代表性產區的艾葉樣本進行了揮發性成分鑒定及多元統計分析，為陜西產艾葉的科學質量控制方法的建立及物質基礎研究提供部分參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 手提式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司，型號：DFT-200A)；萬分之一分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：Sartorius BP61]；超聲波清洗機[小美超聲儀器(昆山)有限公司，型號：XM-P22H]；氣相色譜質譜聯用儀[島津(上海)實驗器材有限公司，型號：QP2010 Plus]。

1.2 試劑 實驗用水為雙蒸水。

1.3 分析樣品 艾葉樣品來自各產區樣本分別于端午前1周采集，陰干后在密閉、25 ℃恒溫保存約1個月后統一分析。所有樣本經陜西省中醫藥研究院中藥研究所黨秋萍副研究員鑒定為艾葉。艾葉樣本產地信息見表1。

表1 艾葉樣本產地信息

2 方法

2.1 樣本制備 取陰干艾葉適量，采用多功能粉碎機粉碎成細粉，精密稱取100 g于圓底燒瓶中，加水1.2 L，以揮發油提取裝置提取5 h，提取完畢讀取揮發油體積后收集揮發油部分，經一次性注射器含0.22 μm的有機濾膜的濾頭濾過后直接進行分析。

2.2 樣本分析 采用島津GC-MS-QP2010 Plus氣相色譜質譜聯用儀進行樣品分析，色譜及質譜參數如下。色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升溫梯度：80～10 ℃/min，300 ℃，5 min；分流比：30∶1；恒線速度模式：30 cm/s；載氣：He；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：300 ℃；進樣口溫度：300 ℃；質量掃描范圍：m/z 29～550；進樣量：0.4 μL。

2.3 數據處理 原始數據導入Nist 2017標準譜庫，經手動扣除背景干擾信息及解卷積后進行碎片離子信息比對，選取匹配度最高的成分進行確認，整理成分峰面積矩陣表。以所鑒定的共有成分作為樣本信息，比較蘄春產艾葉與陜西產艾葉樣本的共性和差異。將21個樣本的峰面積矩陣表導入Origin 2021，選擇中位數聚類法、平方Euclidean距離作為聚類參數，導出樹狀圖分類結果。以揮發性成分峰面積為樣本特征，以產地為變量，按照陜西和蘄春2個產地預先對樣本進行分組，整理數據矩陣，采用MetaboAnalyst 5.0對21批艾葉樣本原始數據分別經過平方根轉換、帕累托轉換，得到標準化數據矩陣后分別進行無監督的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)[8]及有監督的偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)[9]。PLS-DA模型進行內部交叉驗證(Cross Validation)。最后，采用Origin 2021軟件單獨對陜西15個樣本進行主成分分析，提取陜西產艾葉中揮發性成分的主成分特征，數據以主成分特征值、方差貢獻率及累積貢獻率進行評價。

3 結果

3.1 艾葉樣本中揮發性成分鑒定 樣本中成分的離子流主要集中于10～20 min之間，25 min后基本無色譜峰，說明樣本中成分已經充分離子化。樣本GC-MS總離子流見圖1。初步鑒定到13個共有成分，匹配度均大于80。揮發性成分MS信息見表2。

圖1 艾葉樣本GC-MS總離子流圖

表2 揮發性成分MS信息

3.2 蘄春與陜西產艾葉樣本揮發性共有成分的整體聚類分析比較 所分析的21批次艾葉，以揮發性共有峰為主要特征，大體可聚為3類，其中8號(陜南)與12號(陜南)、17號(關中)、13號(陜南)距離較近，聚為一類，16號(關中)與其他所有樣本都較遠，單獨聚為一類，蘄春樣本與所有陜北樣本、部分陜南、關中樣本聚為一類。見圖2。

圖2 蘄春與陜西產艾葉樣本聚類分析

3.3 蘄春與陜西產艾葉樣本揮發性共有成分的整體多元分析比較 由各產地樣本的PCA積分圖(圖3-A)的分布可知，蘄春和陜西產地樣本特征整體重疊，蘄春樣本(紅色圓點)與陜西3個產區樣本(綠色圓點)沒有顯示出明顯分簇的狀態，說明在整體特征上蘄春樣本與陜西3個區域樣本未能體現出差異。PLS-DA得分圖也可發現蘄春和陜西產地樣本依然沒有明顯的分簇(圖3B)。為了驗證PLS-DA模型的預測性能，對所建立的PLS-DA模型進行了內部交叉驗證發現，在基于各主成分的驗證中，模型的R2值均在0.5以下，Q2值出現負值(見圖3-C)，這說明基于蘄春和陜西2個產地分組而建立的PLS-DA模型不能顯示出2組樣本的差異，對樣本進行分組的模型建立不成功，從反面證實了PCA分析的結果。

圖3 蘄春與陜西產艾葉樣本揮發性共有成分的PCA、PLS-DA分析

3.4 陜西產艾葉樣本中揮發性特征成分的主成分分析 總方差的76.04%貢獻來自于主成分1，11.05%來自于主成分2，5.97%來自于主成分3，主成分1、2、3累計貢獻了93.06%的方差，主成分1和主成分2合計貢獻了87.09%方差，從統計出的累計方差結果來看，主成分1和主成分2已經基本可代表陜西產樣本的主要特征，主成分1、2、3合起來能夠更加全面代表陜西產艾葉樣本的特征。見圖4。對主成分1貢獻率較大(系數大于0.6)的成分是α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側柏酮；對主成分2貢獻率較大(系數大于0.6)的成分有薄荷醇、丁香酚、龍腦；對主成分3貢獻率較大的成分有香芹酮、γ-松油烯。此部分的主成分分析結果表明，陜西不同產地艾葉中最主要的揮發性特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側柏酮、薄荷醇、丁香酚、香芹酮、γ-松油烯。其中位于第1主成分的α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側柏酮是本文基于多元統計分析得到的核心成分群。

圖4 陜西產艾葉樣本主成分分析

4 討論

本文對陜西代表性產區的艾葉樣本進行了揮發性成分鑒定及多元統計分析，以期初步得到陜西產艾葉中揮發性成分特征。基于21批次的艾葉中的共有性揮發性成分，分別進行了聚類分析、整體多元統計分析和PCA。PCA是一種無監督的分析方法，默認所有樣本對模型有著同樣的貢獻進行分析，當樣本的組間差異較大，而組內差異較小時，無監督分析方法可以明顯區分組間差異，當樣本的組間差異不明晰，而組內差異較大時，無監督分析方法難以發現和區分組間差異。本文首先按照產地進行分組，分析蘄春組和陜西產艾葉2組的組間差異發現，PCA無法得出2組樣本之間的差異，造成上述結果有2種可能，一種是2個產地樣本之間確實沒有統計意義上的顯著差異，另一種可能是由于組內差異大于組間差異，此時采用PCA得出的結論將不合理。PLS-DA是一種有監督的分類模型，能夠很好地解決無監督分析中遇到的這些問題。但為了避免PLS-DA模型存在的過擬合風險，常常采用內部交叉驗證實驗進行輔助評價所建立模型的預測性能[10]，內部交叉驗證的參數Q2數值越大則表示模型的預測能力越好[11]。一般情況下，模型具備良好的預測性能要求Q2至少大于0.5[12-13]。本實驗結果發現，Q2始終是負值，說明此處所建立的PLS-DA模型不能具備預測組間差異的可靠性能，也可以說從另一角度也說明了組間差異沒有達到足以忽略組內差異，達到組間區分的程度。從PCA和PLS-DA結果均可以看出，陜西的15批次艾葉之間組成的團簇面積較大，說明陜西各個產地艾葉之間也具有一定差異，部分地區樣本與蘄春樣本較為接近，另一部分則區別較明顯，這可能也是造成陜西產艾葉與蘄春產艾葉整體特征無差異的原因之一。此外，本文基于蘄春與陜西15個批次艾葉中共有成分進行了PCA、PLS-DA，對于陜西或蘄春艾葉中的特有成分目前無法共同分析，后期還將繼續就蘄春產艾葉和其他產區艾葉的共性和特性開展工作。

目前，2020版《中華人民共和國藥典》中對于艾葉的質量控制，僅限于桉油精和龍腦2個成分。本文基于主成分分析得出了在統計學意義上陜西產艾葉中的對主成分具有較大貢獻的成分，可為陜西產艾葉的進一步質量評價研究提供實驗依據，其中有不少成分也是文獻[14-17]報道的與艾葉藥理活性相關的成分，如龍腦具有抑菌、鎮靜安神等藥效作用，與艾葉的整體藥效作用相關。α-松油醇對指狀青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03具有明顯抑制作用[18]。側柏酮是一種類單萜酮[19]，是從金鐘柏中分離得到的酊類能增強脾細胞和胸腺細胞增殖、增強細胞因子(如白細胞介素-2、γ干擾素)的作用，具有抗腫瘤能力[20]。此外，α-石竹烯、氧化石竹烯被報道具有鎮痛抗炎活性等[21-22]，β-蒎烯已被證實具有抑菌、殺蟲、抗腫瘤活性，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉油醇、莰烯具有保護細胞氧化應激損傷；丁香酚、芳樟醇、紫蘇醛的抗氧化、抗菌、抗腫瘤等藥理活性均與艾葉的藥理活性高度相關[23-26]。

本文僅從6批蘄春產艾葉和15批陜西產艾葉的13個共有性揮發性成分入手，初步的多元統計分析沒有發現陜西產艾葉與蘄春產艾葉在共性成分特征上有顯著差異，可為陜西產艾葉質量研究提供初步依據；但在今后的研究中，還需要對2個產地艾葉的差異性成分特征進行進一步分析，從而對陜西產艾葉的全面質量控制提供更加全面的數據支撐。

5 結論

本文采用GC-MS方法分析了蘄春及陜西產21批艾葉樣本中揮發性成分，并以揮發性共有峰為樣本特征，通過樣本的聚類分析、PCA、PLS-DA和對成分的PCA，初步發現：陜西產艾葉與蘄春產艾葉在13個揮發性共有成分特征方面，沒有明顯差異；陜西產艾葉揮發性成分的主要特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側柏酮、薄荷醇、丁香酚等。