槐耳發酵液乙酸乙酯部位化學成分的研究

李可心， 呂建華， 董 婧， 范冬雨， 王英平， 李長田*

(1.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學人參新品種選育與開發國家地方聯合工程研究中心，吉林 長春 130118)

槐耳TramesrobiniophilaMurrll.屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、栓菌屬，是一種珍稀的藥用真菌。具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。槐耳多生長在刺槐的死樹、活立木、倒木及樹樁上，分布在東北、華北、華中和西北地區等少數地區[1]。槐耳中含有大量多糖類化合物，也是其重要的活性成分，多用于抗癌和炎癥的治療，而對槐耳的化學成分研究較少[2]。由于槐耳野生資源稀少，采用發酵技術不僅能夠獲得大量穩定的次生代謝產物，而且有利于對槐耳的深度開發利用。因此本研究對槐耳發酵液乙酸乙酯提取物進行化學成分分析，從中分離得到16個化合物，所有化合物均為首次從該真菌發酵液中分離得到。

1 材料

500 L發酵罐(大連富森科技有限公司)；AL104電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；MJ-25085H-II生化培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；YX Q-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；SW-CJ-2D超凈工作臺(上海蘇凈實業有限公司)；QHZ-98B恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Agilent Technologies半制備型高效液相(美國Agilent公司)；ZMD核磁共振儀600 MHz(德國Bruker公司)。

正向柱色譜硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)；ODS反相色譜填料(50 μm，日本YMC公司)；GH0525010C18A制備型反相色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，北京綠百草科技發展有限公司)。甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇(北京永定化工廠)；色譜級甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)；娃哈哈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

槐耳菌株(編號BNCC)存放于吉林農業大學中藥材學院菌物生態學實驗室。

2 提取與分離

將保存在4 ℃冰箱中的槐耳菌種于PDA培養基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、pH 6)上進行轉接活化，25 ℃恒溫培養箱培養7 d。將活化好的槐耳菌種接種到液體培養基(蔗糖20 g、酵母浸粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、蒸餾水1 L、pH 6，接種量12%)，于溫度25 ℃，轉速150 r/min的條件下培養7 d后轉入到400 L發酵培養基中(同液體培養基)，于溫度25 ℃在發酵罐中培養20 d得到發酵產物。

將發酵產物進行過濾后得到發酵液250 L，濃縮至50 L，用乙酸乙酯反復萃取(5次，每次12 h)，將萃取液合并濃縮，得到浸膏350 g。

經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶100)梯度洗脫，得到6個餾份Fr.1～Fr.6。Fr. 4析出白色沉淀化合物1(10 g)。將Fr.3(50 g)進行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.3.1～Fr.3.6，Fr.3.1～Fr.3.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.3.1.1～Fr.3.1.6、Fr. 3.2.1～Fr.3.2.6。Fr.3.2.1進行HPLC半制備分離純化(乙腈∶水)得到化合物2(7 mg)、將Fr.3.2.2和Fr.3.2.3合并進行HPLC半制備分離純化得化合物3(5 mg)、4(6 mg)、5(3 mg)。將剩余Fr.4(60 g)進行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.4.1～Fr.4.6，Fr.4.1～Fr.4.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.4.1.1～Fr.4.1.6、Fr.4.2.1～Fr.4.2.6、Fr.4.3.1～Fr.4.3.6、Fr.4.5.1～Fr.4.5.6、Fr.4.6.1～Fr.4.6.6，將Fr.4.6.1進行HPLC半制備分離純化得化合物6(2 mg)；將Fr.4.2.2進行HPLC半制備分離純化得化合物7(2 mg)、8(2 mg)；將Fr.4.1.5進行HPLC半制備分離純化得化合物9(6 mg)；將Fr.4.6.3進行HPLC半制備分離純化得化合物10(5 mg)；將Fr.4.3.1進行HPLC半制備分離純化得化合物11(7 mg)；將Fr.4.2.1進行HPLC半制備分離純化得化合物12(5 mg)；將Fr.4.3.3進行HPLC半制備分離純化得化合物13(3 mg)。將Fr.6(45 g)加入水，用乙酸乙酯萃取(3次，每次12 h)后濃縮，進行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.6.1～Fr.6.6，Fr.6.1～Fr.6.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.6.1.1～Fr.6.1.6、Fr.6.2.1～Fr.6.2.6。Fr.6.1.1進行HPLC半制備分離純化得化合物14(4 mg)；Fr.6.2.1進行HPLC半制備分離純化得化合物15(5 mg)、16(3 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末(甲醇)，分子式C4H4N2O2，ESI-MSm/z：112.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：11.41(2H，brs，1-NH，3-NH)，7.37(1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：165.2(C-4)，152.2(C-2)，142.9(C-6)，101.0(C-5)。以上數據與文獻[3]基本一致，故鑒定為尿嘧啶。

化合物2：白色粉末(甲醇)，分子式C8H8O4，ESI-MSm/z：168.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.45(1H，s，H-2)，7.45(1H，d，J=9.8 Hz，H-6)，6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.69(3H，s，8-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：173.4(C-7)，150.1(C-4)，144.6(C-3)，122.5(C-1)，121.8(C-6)，116.4(C-5)，114.4(C-2)，50.8(-OCH3)。以上數據與文獻[4]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物3：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O4，ESI-MSm/z：154.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.34(1H，s，H-2)，7.29(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-2)，117.0(C-5)，122.2(C-6)，122.3(C-1)，145.3(C-3)，150.4(C-4)，167.8(C-7)。以上數據與文獻[5]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物4：黃色油狀(甲醇)，分子式C9H12O2，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.35～7.26(4H，m，H-5，6，8，9)，7.25～7.19(1H，m，H-7)，4.28(1H，d，J=6.2 Hz，H-1)，3.65(1H，m，H-2)，0.83(3H，d，J=6.2 Hz，H-3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：143.5(C-4)，128.1(C-6，8)，127.5(C-5，9)，127.2(C-7)，78.0(C-1)，71.1(C-2)，19.2(C-3)。以上數據與文獻[6]基本一致，故鑒定為1-苯基-1，2-丙二醇。

化合物5：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O2，ESI-MSm/z：211.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.00(1H，s，H-8)，4.19(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，4.00(1H，dd，J=7.4，5.2 Hz，H-9)，3.49～3.22(3H，m，H-3，H-5)，2.12(1H，m，H-5)，1.96～1.60(4H，m，H-10，4)，1.35(1H，m，H-11)，0.87(3H，d，J=6.0 Hz，H-12)，0.86(3H，d，J=6.0 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.8(C-1)，167.0(C-7)，58.9(C-6)，53.1(C-9)，45.3(C-3)，38.2(C-10)，27.9(C-5)，24.5(C-11)，23.3(C-4)，22.9(C-13)，22.4(C-12)。以上數據與文獻[7]基本一致，故鑒定為環(亮氨酸-脯氨酸)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，分子式C12H14N2O2，ESI-MSm/z：218.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.11(1H，s，2-NH)，8.01(1H，s，5-NH)，7.28(2H，dd，J=8.0，6.7 Hz，H-3′，5′)，7.25～7.19(1H，m，H-4′)，7.18～7.12(2H，m，H-2′，6′)，4.23～4.09(1H，m，H-6)，3.69～3.58(1H，m，H-3)，3.13(1H，dd，J=13.4，3.7 Hz，H-7)，2.86(1H，dd，J=13.4，4.8 Hz，H-7)，0.47(3H，d，J=7.0 Hz，H-8)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-5)，166.4(C-2)，136.5(C-9)，130.9(C-11，13)，128.5(C-10, 14)，127.2(C-12)，56.6(C-3)，51.0(C-6)，20.2(C-8)。以上數據與文獻[8]基本一致，故鑒定為環(苯丙氨酸-丙氨酸)。

化合物7：無色油狀(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：227.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.96(1H，s，H-8)，5.09(1H，s，4-OH)，4.28(1H，t，J=4.8 Hz，H-4′)，4.00(1H，brs，H-9)，3.53(1H，dd，J=4.8，12.6 Hz，H-3)，3.21(1H，d，J=12.6 Hz，H-3′)，2.04(1H，dd，J=6.6，13.2 Hz，H-5)，2.01(1H，m，H-10)，1.88(1H，ddd，J=4.8，11.4，13.2 Hz，H-5′)，1.34(1H，m，H-11)，1.28(1H，m，H-11′)，0.98(3H，t，d，J=7.8 Hz，H-13)，0.82(3H，t，J=7.2 Hz，H-12)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.5(C-7)，165.3(C-1)，66.8(C-4)，59.1(C-9)，56.7(C-6)，53.8(C-3)，37.2(C-5)，34.8(C-10)，23.9(C-11)，14.9(C-13)，12.3(C-12)。以上數據與文獻[9]基本一致，故鑒定為環(4-S-羥基-R-脯氨酸-R-異亮氨酸)。

化合物8：白色粉末(甲醇)，分子式C11H12N2O2，ESI-MSm/z：204.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.14(1H，brs，H-6)，7.88(1H，brs，H-3)，7.28(3H，m，H-3′ -4′ -5′)，7.17(2H，m，H-2′，6′)，4.06(1H，m，H-2)，3.35(1H，dd，J=3.0，18.0 Hz，H-5)，3.09(1H，dd，J=4.2，13.2 Hz，H-7)，2.88(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-7′)，2.77(1H，d，J=17.4 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.1(C-1)，165.6(C-4)，136.0(C-1′)，130.0(C-2′，6′)，128.1(C-3′，5′)，126.7(C-4′)，55.5(C-2)，43.7(C-5)，38.8(C-7)。以上數據與文獻[10]基本一致，故鑒定為環(苯丙氨酸-甘氨酸)。

化合物9：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.17(1H，d，J=3.8 Hz，8-NH)，7.36～7.22(3H，m，H-2′-4′)，7.18～7.10(2H，m，H-5′，6′)，4.97(1H，s，4-OH)，4.19(1H，t，J=6.0，4.4 Hz，H-4)，4.00(1H，q，J=5.0 Hz，H-9)，3.59(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H-6)，3.06(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.04(1H，dd，J=13.6，5.9 Hz，H-10)，2.91(1H，dd，J=13.6，5.0 Hz，H-10)，1.86(1H，dd，J=12.8，6.1 Hz，H-5)，1.69(1H，td，J=12.2，4.4 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：169.2(C-7)，165.3(C-1)，136.4(C-1′)，130.2(C-2′-6′)，128.7(C-3′，5′)，127.3(C-4′)，66.5(C-4)，58.4(C-9)，56.0(C-6)，54.5(C-3)，39.8(C-10)，38.3(C-5)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為環(D-羥脯氨酸-L苯丙氨酸)。

化合物10：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.98(1H，s，8-NH)，7.31～7.19(5H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′)，4.40(1H，t，J=5.2 Hz，H-9)，4.31(1H，dd，J=11.2，6.3 Hz，H-6)，4.19(1H，t，J=4.7 Hz，H-4)，3.52(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.16(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.08(1H，dd，J=14.2，5.4 Hz，H-10)，3.01(1H，dd，J=14.2，5.0 Hz，H-10′)，1.94(1H，dd，J=12.8，6.2 Hz，H-5)，1.52(1H，td，J=12.0，4.6 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.6(C-10)，37.7(C-5)，54.3(C-3)，56.1(C-9)，57.4(C-6)，67.2(C-4)，126.8(C-4′)，128.4(C-3′，5′)，130.2(C-2′，6′)，137.8(C-1′)，165.7(C-1)，170.0(C-7)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為環(L-苯丙氨酸-L羥脯氨酸)。

化合物11：無色晶體(甲醇)，分子式C8H8O3，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：10.50(s，1H，4-OH)，7.80(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，3.78(3H，s，-COOCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：166.5(C-7)，162.8(C-4)，131.9(C-2)，120.4(C-1)，115.9(C-3)，52.1(COOCH3)。以上數據與文獻[12]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸甲酯。

化合物12：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O3，ESI-MSm/z：138.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.1(-COOH)，163.3(C-4)，133.0(C-2，6)，122.8(C-1)，116.0(C-3，5)。以上數據與文獻[13]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物13：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O2，ESI-MSm/z：123.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：9.57(1H，S，H-7)，7.76(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：191.4(C-7)，164.0(C-4)，132.1(C-2，6)，128.8(C-1)，115.5(C-3，5)。以上數據與文獻[14]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物14：黃色針狀晶體(甲醇)，分子式C9H10O4，ESI-MSm/z：182.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，dd，J=8.0，2.3 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.29(2H，q，J=7.0 Hz，H-8)，1.36(3H，t，J=7.0 Hz，H-9)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.2(C-7)，150.3(C-4)，144.8(C-3)，122.2(C-1)，121.4(C-6)，116.0(C-2)，114.5(C-5)，60.4(C-8)，13.3(C-9)。以上數據與文獻[15]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸乙酯。

化合物15：白色粉末(甲醇)，分子式C9H16N2O2，ESI-MSm/z：184.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.10(1H，brs，H-4)，7.96(1H，brs，H-1)，3.88(1H，q，J=6.0 Hz，H-3)，3.74(1H，m，H-6)，1.85(1H，m，H-8)，1.39(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J=7.2 Hz，H-7)，1.18(1H，m，H-9′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-11)，0.84(1H，t，J=7.2 Hz，H-10)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-2)，166.6(C-5)，58.8(C-6)，49.6(C-3)，38.0(C-8)，24.2(C-9)，15.0(C-11)，11.9，(C-10)。以上數據與文獻[16]基本一致，故鑒定為環(丙氨酸-異亮氨酸)。

化合物16：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：226.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.31(1H，d，J=4.8 Hz，H-8)，4.99(1H，s，4-OH)，4.23(1H，m，H-4′)，4.22(1H，m，H-6)，3.62(1H，dt，J=4.8，9.6 Hz，H-9)，3.46(1H，dd，J=3.6，12.0 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=5.4，12.0 Hz，H-3′)，2.26(1H，ddd，J=5.4，9.0，13.8 Hz，H-5)，2.04(1H，m，H-5′)，1.68(1H，m，H-11)，1.56(1H，m，H-10)，1.43(1H，m，H-10′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-12)，0.87(1H，d，J=6.6 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-7)，166.4(C-1)，66.8(C-4)，55.8(C-6)，55.1(C-9)，52.9(C-3)，41.9(C-10)，36.5(C-5)，23.9(C-11)，22.8(C-12)，21.5(C-13)。以上數據與文獻[17]基本一致，故鑒定為環(D-亮氨酸-反-4-羥基-L-脯氨酸)。

4 討論

本研究從槐耳發酵液乙酸乙酯提取物中分離鑒定了16個化合物，包括1個含氮類、1個苯丙素類、6個酚酸類和8個環二肽類，以上化合物均為首次從該真菌發酵液中分離得到。本研究對槐耳進行液體發酵培養時，所用培養基中含有酵母浸粉，其含有蛋白質、氨基酸、肽、多肽、核酸等營養成分。艾洪蓮等[18]從黃連內生真菌發酵液中分離出酚酸類和環二肽類化合物，但其液體培養基中未用酵母浸粉。樺褐孔菌和靈芝子實體中也分離出酚酸類和環二肽化合物[19-20]，而槐耳是與樺褐孔菌和靈芝相似的藥用真菌，因此，以上均為該真菌中的化合物。酚酸類化合物具有抗肝癌、抗氧化，抗炎、降血脂等作用[21-22]；環二肽化合物具有調節免疫、抗腫瘤、抗真菌等作用[23-24]。因此，推測酚酸類和環二肽類可能為槐耳發酵液乙酸乙酯提取物中主要的有效成分。今后，將繼續對分離得到的單體化合物進行活性篩選，以期為槐耳發酵液的深度開發利用提供理論依據。