趨化因子CXC配體1影響人口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移的作用機制

王燕琴 陳剛 楊松 孫盛洋 任秀英 王偉群 曲義坤

(佳木斯大學 1醫務處校醫院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫院；3基礎醫學院)

頭頸部癌是上呼吸道和消化道上皮層最常見的惡性腫瘤，其主要包括鼻咽癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、口腔癌和喉癌等〔1〕。病理分型顯示，頭頸部最常見的腫瘤是鱗狀細胞癌，約占所有頭頸部惡性腫瘤的90%〔2〕?？谇击[狀細胞癌(OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，臨床上可見于牙齦、頰黏膜、硬腭、嘴唇、舌體等多個器官，具有惡性程度高、快速和無限生長、較易浸潤和轉移、預后差、危害大等特點〔3,4〕。OSCC可占頭頸部癌癥的95%左右，并呈現逐年上升趨勢，僅過去10年其發病率就增加了50%〔5〕。據統計在2003年OSCC還是全球第八大常見癌癥，而到了2016年，其已經上升為全球第六大惡性腫瘤〔6,7〕。1975～1977年，OSCC患者5年相對存活率為52.5%，但在隨后的40年中患者每10年的存活率僅增加了2%～3%〔8〕。趨化因子是由機體細胞分泌的一類小的細胞因子信號蛋白家族，其已被認為是在機體免疫監測、發育、炎癥和癌癥進展等過程中調節細胞遷移的關鍵介質家族。趨化因子功能的實施主要是通過與不同類型細胞表面的七次跨膜G蛋白耦聯受體 (GPCR) 結合，進而觸發細胞的運動和激活細胞所必需的信號通路得以實現〔9〕。趨化因子GPCRs主要由白細胞表達，最初發現其主要功能是參與白細胞運輸和歸巢、整合素的激活、超氧陰離子的產生及顆粒內容物的釋放，這些功能可構成宿主抵抗入侵微生物和組織損傷的第一道防線〔10〕。趨化因子家族成員的分子量為8～10 kD，根據靠近氨基端的前兩個半胱氨酸的位置，趨化因子蛋白可被分為4個高度保守的家族，分別為CXC、CC、C和CX3C。人們已經發現了50多種趨化因子和至少有18種人類趨化因子GPCRs〔11〕。除了經典的趨化因子GPCRs外，人們最近又鑒定出一些非典型趨化因子受體，它們包括ACKR1～6〔12〕。趨化因子/GPCRs軸的一個顯著特征是具有混雜的對應關系，一方面一些趨化因子可結合一個以上的GPCRs，而另一方面有些GPCRs也表現出不同親和力的重疊配體特異性〔13〕。趨化因子/GPCRs軸的這種混雜性有利于宿主根據微環境的變化靈活地動員細胞內各種機制〔13〕。除了介導免疫細胞向炎癥部位遷移外，趨化因子還被發現在淋巴組織的發育、免疫細胞的成熟及適應性免疫應答中具有關鍵作用〔14〕。此外，趨化因子及其相應受體表達失衡還與人類許多疾病如自身免疫性疾病、炎癥性疾病及腫瘤等有關〔15〕。在腫瘤中，趨化因子具有直接或間接地影響腫瘤免疫、腫瘤生物表型、腫瘤進展、腫瘤治療和患者預后等作用〔16〕。研究證實，在腫瘤微環境(TME)中，腫瘤相關宿主細胞和腫瘤細胞均可釋放一系列不同種類的趨化因子，來引導不同類型免疫細胞的招募和激活，最終影響抗腫瘤和促腫瘤之間的平衡〔17〕。除了發揮趨化細胞的主要功能外，趨化因子還可通過直接靶向TME非免疫細胞(如腫瘤細胞和血管內皮細胞)，來影響腫瘤發展演進的多個進程，如腫瘤細胞的生長、轉移和血管生成等〔16〕。研究證實，腫瘤細胞可刺激基質細胞合成和分泌促進生長的趨化因子，從而建立一種有利于腫瘤進程的腫瘤-間質相互作用〔18〕。此外，TME的輔助細胞，如腫瘤相關成纖維細胞(TAMs)和腫瘤相關巨噬細胞(TAFs)，也被證明可以產生趨化因子并促進腫瘤進程〔19，20〕。本實驗旨在研究趨化因子CXCL1影響人口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗所需細胞和試劑 KB人口腔鱗狀細胞癌細胞株(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)、DMEM培養基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美國NQBB公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、胰蛋白酶(上海碧云天生物技術有限公司)，重組人趨化因子CXCL1蛋白(美國PeproTech公司)、放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解緩沖液和苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(北京白鯊易科技有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程公司)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國MerckMillipore公司)、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司)、增強化學發光(ECL)超敏顯影液(上海研生生化試劑有限公司)、單克隆小鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam公司)、多克隆兔抗人AKT抗體(美國Affinity Biosciences公司)。

1.2CCK-8細胞增殖檢測 將處于對數生長期的KB人口腔上皮癌細胞株進行常規消化和計數；加入適量DMEM完全培養基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 鏈霉素)將細胞密度調至2.0×104個/ml；吹打混勻細胞后，向每96孔板中均勻鋪入100 μl細胞懸液，使細胞數量為2×103個/孔；將培養孔中的細胞隨機分為對照組和CXCL1處理組，每組設置10個復孔；對照組細胞培養基中不加CXCL1；CXCL1各處理組加入CXCL1以使各組培養基CXCL1終濃度為5、10、20和30 ng/ml；將細胞在37℃ CO2培養箱中培養72 h；分別向每孔中加入10 μl CCK8檢測試劑，然后在37℃ CO2培養箱中孵育2 h；利用酶標儀讀取各孔450 nm波長的吸光度值。

1.3Transwell細胞遷移檢測 將處于對數生長期的KB人口腔鱗狀細胞癌細胞株用無FBS的DMEM培養基調至密度為1.0×105個/ml；吹打混勻細胞后，將100 μl細胞懸液均勻加入Transwell上室中，使細胞數量為1×104個/室；將小室中的細胞隨機分為對照組和CXCL1處理組，每組設置5個復孔；對照組下室的培養基為含10%FBS的DMEM完全培養基；CXCL1各處理組下室的培養基分別為CXCL1終濃度為5、10、20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培養基；將細胞在37℃ CO2培養箱中培養24 h；用脫脂棉簽擦拭掉小室上表面未遷移的細胞；用甲醇-結晶紫液對附著在下表面的細胞進行固定和染色5 min；自來水沖洗5 min后在室溫環境下干燥15 min；于倒置顯微鏡下拍照并計數，以觀察細胞遷移情況。

1.4Western印跡實驗 將處于對數生長期的KB人口腔上皮癌細胞株培養在6孔板中；對照組的培養基為含10%FBS的DMEM完全培養基；CXCL1各處理組的培養基分別為CXCL1終濃度為20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培養基；將細胞在37℃ CO2培養箱中培養72 h；胰蛋白酶消化后收集細胞懸液，室溫離心10 min(1 000 r/min)；去除上清后，向細胞沉淀中加入150 μl 含1%PMSF的RIPA蛋白裂解緩沖液，劇烈吹打以使細胞充分裂解；在4℃環境下于高速離心20 min(15 000 r/min)；收集上清液，利用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白濃度；將30 μg總蛋白上樣于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠孔道中并進行垂直電泳，然后將凝膠中蛋白轉印到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉后，轉印膜分別用β-actin(1∶5 000)和AKT(1∶1 000)一抗在4℃環境下孵育過夜；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)緩沖液洗除一抗后，將轉印膜分別用HRP-羊抗小鼠IgG(1∶10 000)和HRP-羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗在37℃環境下孵育30 min；PBS-T緩沖液徹底洗滌后，將ECL試劑滴加到轉印膜上反應，然后利用凝膠成像系統拍照并測定條帶灰度值。

1.5統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1趨化因子CXCL1促進KB細胞的增殖活性 各組細胞生長72 h后，經CCK-8實驗檢測所示，對照組、5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組的吸光度值分別為1.201±0.007、1.503±0.005、1.695±0.010、1.941±0.015和1.661±0.009。與對照組比較，5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細胞的增殖能力顯著增強(P=0.000)。該結果表明，趨化因子CXCL1對KB人口腔鱗狀細胞癌細胞株的增殖活性有明顯促進作用。

2.2趨化因子CXCL1促進KB細胞的遷移活性 各組細胞遷移24 h后，經Transwell實驗檢測所示，對照組、5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組的遷移細胞數分別為(101.2±53.101)個、(286.0±49.300)個、(327.0±38.962)個、(340.6±50.073)個和(293.6±28.112)個。與對照組比較，5、10、20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細胞的遷移能力顯著增強(P=0.001；P=0.000)。該結果表明，趨化因子CXCL1對KB人口腔鱗狀細胞癌細胞株的遷移活性有明顯促進作用。

2.3趨化因子CXCL1上調KB細胞AKT蛋白水平 對照組、20和30 ng/ml CXCL1處理組AKT蛋白表達水平分別是0.539±0.048、0.905±0.090和0.700±0.091。與對照組比較，20和30 ng/ml CXCL1處理組KB細胞的AKT蛋白表達水平顯著上調(P=0.003；P=0.006)。

3 討 論

炎癥是TME的重要組成部分，也是腫瘤的重要標志之一。腫瘤相關炎癥的主要特征包括白細胞(特別是TAFs)的浸潤，炎癥多肽信使如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1和趨化因子CXCL8等的存在及組織重塑和血管發生等〔21〕。研究發現，某些癌癥中的炎癥狀況要先于惡性腫瘤的發展，而在另一些癌癥中，致癌性變化則可對相應促腫瘤炎癥環境發揮驅動作用〔22〕。然而，無論炎癥如何起源，其都有助于促進惡性細胞的增殖、存活與轉移，刺激血管生成及改變腫瘤細胞對激素和化療的敏感性〔22〕。趨化因子是一類小分子分泌性細胞因子家族成員，其最初被發現是嗜中性粒細胞和單核細胞等白細胞的有效引誘劑，因此被認為是急、慢性炎癥的重要介質。近年來，越來越多的證據表明，除了炎癥外，趨化因子可在機體的發育、穩態的維持及多種病理生理過程如骨質疏松、肥胖和腫瘤中發揮重要調節作用〔23〕。在腫瘤研究中，人們首先發現趨化因子在決定腫瘤間質的組成方面具有關鍵作用，但后來證實其亦可直接影響腫瘤細胞的增殖、轉移和血管形成〔24〕。腫瘤的生長和擴散是腫瘤細胞本身及其與TME組分之間動態相互作用的結果。在這方面，趨化因子即可參與腫瘤細胞向轉移部位的歸巢，又可參與不同類型細胞如TAMs、CAFs、腫瘤相關中性粒細胞(TANs)、淋巴細胞、間充質干細胞(MSCs)和內皮細胞向TME招募〔23〕。研究證實，腫瘤部位的炎性相關CC(如CCL2、CCL3、CCL5)和CXC(如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8)趨化因子可招募表達趨化因子CC配體受體2+(CCR2+)的單核細胞和趨化因子CXC配體受體2+(CXCR2+)的中性粒細胞進入TME，并促使后者分化為TAMs和TANs〔25〕。TME中腫瘤細胞、腫瘤相關細胞及白細胞均可分泌多種趨化因子，它們可與腫瘤細胞表達的趨化因子受體相結合，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外調節蛋白激酶(ERK)等信號通路來促進腫瘤細胞的增殖〔26,27〕。此外，趨化因子還可通過阻止腫瘤細胞的凋亡和調節促凋亡/抗凋亡分子之間的平衡，如下調B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達或抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和caspase-9激活來促進腫瘤細胞的存活〔28〕。CXCL1又名生長相關癌基因蛋白(GRO)-α，其可通過與其受體CXCR2的相互作用經多條信號途徑參與腫瘤細胞的惡性進程〔29〕。本研究證實，CXCL1處理后KB細胞AKT蛋白水平也出現上調，這與我們在BEL-7402肝癌細胞的研究結果相一致〔30〕。