模式識別受體PRRs在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發病機制中的作用研究進展①

刁一芮 丁奇 史淵源

（北京中醫藥大學，北京 100029）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是繼發于肺內或全身的炎癥反應過程，由肺泡損傷導致并形成炎癥性非心源性的肺水腫。該綜合征表現為急性低氧血癥，胸部顯像顯示雙側肺浸潤，并不完全由心力衰竭引起［1］。其有多種病因如敗血癥，細菌性肺炎，胃內容物的吸入以及流行病毒等，例如H1N1和SARS，常導致爆發性呼吸衰竭和死亡［2］。如SARS-CoV和流感病毒感染所見，病原體誘發的肺損傷可發展為ALI/ARDS，ARDS是感染SARS-CoV或MERS-CoV患者死亡的主要原因［3-4］。2019年11月，中國湖北武漢出現新型冠狀病毒SARS-CoV-2，其感染常導致致死性炎癥反應和ALI，其炎癥機制可能與病毒快速復制、細胞損傷、ACE2和抗病毒中和抗體（anti-S protein-neutralizing antibodies，anti-S-IgG）有關［5-6］。在過去20年中，ARDS的病死率一直保持在40%左右。目前以支持治療為主，重點是治療基礎疾病和床邊護理，包括機械通氣以及許多臨床試驗中使用的藥物，如外源性表面活性物質、皮質類固醇以及β2受體激活物和他汀類藥物［7］。ARDS機制研究主要集中潛在生物標志物，如促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18中［8］。柏林定義（Berlin definition）是目前醫學界共識的診斷標準，在低氧血癥的基礎上，ARDS輕度（動脈血氧分壓與吸入氧氣之比200 mmHg

模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）是天然免疫系統中第一道防線的重要組成，在ALI/ARDS先天和適應性免疫反應中起著關鍵作用［8］。PRRs激活先天免疫并調節后天免疫對感染和非感染免疫組織損傷，可促進全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。PRRs包括Toll樣受體，NOD樣 受 體和RIGI樣受體［11］。PRRs可識別兩類配體，病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），是從壞死或垂死細胞釋放的內源性分子［8，12］。TNF-α、IL-1β和IL-18等促炎因子的釋放依賴于PRRs啟動炎癥信號級聯反應，刺激自噬或細胞凋亡并誘導產生抗菌分子［8，12］。PRRs與PAMPs或DAMPs之間的相互作用導致轉錄因子的激活，上調炎癥反應相關基因的轉錄，這些基因編碼促炎細胞因子、趨化因子以及參與PRRs信號調節的蛋白等［11，13］。PAMPs包含細菌細胞壁成分，如脂多糖（LPS）、細菌DNA序列、病毒RNA等。DAMPs包括熱激蛋白（heat shock proteins，HSP）、纖維蛋白原、透明質酸以及高遷移率蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）等［11］。

1 PRRs的種類

肺泡上皮由肺泡Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞構成，大約95%的肺內表面由Ⅰ型肺泡細胞構建，兩種細胞類型通過其基底膜融合到內皮細胞中，共同形成氣體交換屏障。Ⅱ型肺泡細胞履行許多已知的功能，包括肺表面活性物質系統、肺泡液含量以及對損傷的Ⅰ型細胞替代具有重要作用［14］。Ⅱ型肺泡細胞和TLRs結合誘導趨化因子將免疫細胞募集到空域。嗜中性粒細胞跨上皮細胞遷移會釋放毒性介質，如蛋白酶，ROS和NETs，它們在宿主防御中有重要作用，但會引起內皮和上皮損傷［10］。內皮損傷標志物主要為內皮素-1和VWF抗原［7］。PRRs一類包括細胞外環境中識別PAMPs和DAMPs且位于血漿和內體膜上的Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）［15］。另一類包括識別細胞內環境中的DAMPs的RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptor，RLRs），HIN200和NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs），廣泛存在于細胞質中［15］。對病原體識別有意義的一點是TLRs和NLRs均具有LRR域而不具有CARD解旋酶［14］。

2 ALI/ARDS中相關PRRs的結構和功能

2.1 跨膜PRRs據報道人類已經鑒定出10種功能性TLRs，負責感應細胞外、細胞內的內泌體和溶酶體中的入侵病原體，即在脊椎動物中高度保守的跨膜PRRs，包括定位于質膜的TLR2/1、TLR2/6、TLR4、TLR10以及定位于核內體的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9［8，13］。具有不同N端糖基化程度的N末端富含亮氨酸的重復（leucine-rich repeat，LRR）結構域形成了負責病原體感應的特征性TLRs螺線管結構。單個跨膜結構域將LRR結構域連接到胞質Toll/IL-1受體（toll-like receptor/interleukin-1 receptor，TIR）C端尾端，該尾部募集TIR銜接子蛋白以啟動下游信號轉導［16］。

2.2 胞質PRRs NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）是可溶性胞質蛋白，由C端LRR結構域，中央核寡聚域（nuclear oligomerization domain，NOD）和可變N端效應域組成。通過其效應結構域進一步分為胱天蛋白酶募集結構域（caspase recruitment domain，CARD or NLRCs），熱蛋白結構域（pyrin domain，PYD or NLRPs）或凋亡蛋白結構域的桿狀抑制物（baculoinhibitor of apoptosis protein domain，NAIPs or NLRBs）［16］。與TLRs可以識別表面上的病原體相關分子模式（PAMPs）不同，NLRs在細胞內部被激活并形成炎癥體的一部分，由具有不同NLRs（例如NLRP1b，NLRP3和NLRC4）的多蛋白復合物形成，這些炎癥體還可以作為caspase-1激活平臺來控制IL-1β和IL-18等白介素的成熟和分泌［17-18］。肺上皮細胞表達的NLRs包括NOD1和NOD2，其可以結合細菌肽聚糖，激活MAPK信號通路、NF-κB信號通路和自噬通路［16］。

RLRs是 胞 質PRRs，RLRs是DExD/H結 構 域RNA解旋酶家族的成員，可檢測導致IFN（例如IFN-α和IFN-β）產生的RNA病毒，RLR家族包括RIG-Ⅰ，MDA5，LGP2受體［19-20］。RIG-Ⅰ和MDA5含有RNA解旋酶結構域和兩個能觸發下游信號通路的CARD樣結構域，而LGP2缺乏CARD樣結構域［19］。據研究LGP2可以調節RIG-Ⅰ和MDA5信號傳導。在病毒感染期間，RIG-Ⅰ被dsRNA或5'-ppp RNA激活，而MDA5被dsRNA激活［20］。

3 PRRs在ALI/ARDS中的角色

3.1 TLRs在肺上皮細胞和經典免疫細胞之間，TLRs的表達和定位可能不同，研究發現在炎癥條件下，TLR4重新定位于細胞膜，且對LPS敏感性增加，已被RSV感染的肺上皮細胞實驗研究證實［14］。刺激TLR4可以觸發兩個下游信號傳導途徑的激活：依賴MyD88或依賴TRIF的途徑。研究表明，通過TLR4-TRIF-TRAF6進行的先天性免疫信號傳導是決定體內急性肺衰竭易感性的關鍵遺傳途徑［21］。一般情況下，PRRs活化炎癥的主要方面是NF-κB依賴性基因轉錄，另一方面是IFN調節因子依賴性基因轉錄導致了IFN的產生以及隨后IFN刺激基因的表達［14］。研究表明，LPS作為配體可以激活細胞膜上的TLR4，并啟動下游炎癥反應信號通路的表達，并最終通過上調炎癥或壞死因子IL-1β、IL-6和TNF-α，產生炎癥反應［22］。TLR信號通路中的TLR2在LPS誘導的ALI組織中顯著過表達，實驗發現甘草酸通過抑制TLR2可以減少LPS引起的ALI［23］。

3.2 NLRs NLRP3屬于NOD樣受體家族，是研究最多的NLRs，可以被PAMPs與DAMPs信號激活，形成多聚體蛋白復合物，稱為NLRP3炎癥體［15］。研究發現幾種分子和細胞事件可以作為NLRP3炎癥體激活的觸發因素，包括K+外排、Ca2+信號傳導、ROS、線粒體功能障礙和溶酶體破裂［24］。NLRP3炎癥體作為一種細胞炎癥反應途徑，其高表達通常會觸發慢性炎癥反應過程并最終釋放IL-1β和IL-18［22］。炎癥體激活的標志是caspase-1介導的促炎細胞因子IL-1β和IL-18的分泌［25］。NLRP3的缺失可以防止高氧血癥引起的ALI，因此，NLRP3炎癥體可能是ALI藥物治療的有效靶點［26］。

3.3 RLRs RLRs家族受體RIG-Ⅰ和MDA5在病毒感染后，可以靶向病毒復制復合物（viral replication complexes，vRC），進而感知應激顆粒中的RNA病毒并形成抗病毒應激顆粒（antiviral stress Granules，avSG）［27］。MDA5或RIG-Ⅰ的激活會導致CARD與病毒信號（mitochondrial activator of virus signaling，MAVS）蛋白線粒體激活物的CARD相互作用，MAVS是RLRs的必需信號轉導接頭蛋白［28］。RIG-Ⅰ和MDA5通過共同的銜接子MAVS信號響應病毒感染而產生IFN，RLR級聯分泌的IFN-β與IFN受體結合，以指導JAK-STAT信號傳導和IFN刺激基因（interferon stimulated genes，ISG）ISGF3的依賴性表達，RLRs也導致IL-10家族細胞因子Ⅲ型干擾素（IFN-λ）的表達［29］。RLRs信號可與炎癥體信號相互串擾，研究發現RNA病毒感染可通過MAVS誘導炎癥體活化，MAVS與NLRP3相互作用并與線粒體相關膜（mitochondrial associated membrane，MAM）直接締合，并促進NLRP3寡聚化，導致caspase-1激活并釋放成熟的IL-1β驅動炎癥反應［28］。

4 調控ALI/ARDS的作用機制

4.1 TLRs介導NF-κB信號通路有研究發現，禽流感病毒感染引起的ALI產生內源性氧化磷脂，可刺激TLR4，并發現缺乏TLR4的小鼠對禽流感致死率有耐藥性，TLR4遺傳失活可以顯著減弱ALI，而TLR3、TLR9對肺病理沒有影響，ALI的嚴重程度受造血細胞上TLR4表達的控制，并將TLR4鑒定為ALI的易感基因［13-21］。根據不同的適配器分子骨髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和TRIF的使用情況，TLR信號通路大致可分為兩種不同的通路［13］。MyD88是TLR/IL-1受體（toll-like receptor/interleukin-1 receptor，TIR）通路的關鍵適配器，TIR能夠促進ALI進展［30］。除TLR3外，所有TLR都共享MyD88依賴性途徑來激活NF-κB。由TIRAP、MyD88、IRAK4、IRAK1和TRAF6組成的蛋白質復合物介導NF-κB刺激［14］。已被證實TLR4/TRAM/TRIF信號級聯在流感病毒感染和酸性損傷模型可引起ALI/ARDS加重。TRIF信號通過IKK-?和IRF3激活或通過TRAF6介導的NF-κB激活［21］。MyD88依賴TIR激活可引起下游分子核轉錄因子NF-κB激活，NF-κB激活導致編碼炎癥性細胞因子，急性期蛋白，免疫受體和趨化因子的基因表達增強，這些因子在募集嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，巨噬細胞和淋巴細胞中扮演重要角色［30-31］。NF-κB激活后可進入細胞核，促進多種炎癥因子的釋放，如IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等［32］。MyD88基因敲除可抑制NF-κB激活，減少TNF-α和IL-1的表達和釋放，可減緩ALI/ARDS［30］。

4.2 NLRP3炎癥體及其信號通路NLRP3炎癥體活化和IL-1β的后續成熟與ALI有關，導致炎癥和纖維化。纖維增生在ARDS患者中較早出現，NLRP3炎癥體的激活在ALI和肺纖維化中起重要作用，NLRP3炎癥體的產物IL-1β是肺部急性炎癥，是重塑和纖維化的關鍵介質，通過促進促纖維化介質的表達和成纖維細胞的活化，導致膠原沉積在肺內［33-34］。研究表明，NLRP3炎癥體在各種感染性病因如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和病毒病原體如A型流感病毒引起的ALI中起關鍵作用［33，35］。細菌內毒素如LPS是可以激活TLR4受體，并通過NF-κB途徑來上調NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18的基因表達［15，18］，NLRP3炎癥體活化可能與波形蛋白相關，其激活需要兩個信號：第1個信號由微生物分子或內源性細胞因子介導，通過激活NF-κB信號通路上調NLRP3和pro-IL-1β的表達［33］。第2個信號由DAMPs介導，導致多蛋白復合物組裝。激活后，caspase-1蛋白水解細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，導致IL-1β和IL-18的成熟和釋放，IL-1β和IL-18分泌到肺環境中會導致ALI［35］。

4.3 MAPK信號通路在ALI/ARDS中的細胞因子如IL-1β、TNF-α等，主要是通過p38 MPAK信號通路，由幾個的TLRs誘導的促炎癥信號以及NOD1和NOD2涉及ERK、JNK和p38 MAPK激活［36］。MAPK信 號 組 分，包 括p38 MAPK、JNK、ERK［37］。p38 MAPK在多種環境和細胞壓力或炎癥細胞因子的作用下被強烈激活，其包括多個亞型［38］。目前大多數研究都集中在p38α上，p38γ和p38δ的作用有時被忽略［39］。研究表明，在作為炎癥反應關鍵介質的巨噬細胞和樹突狀細胞中，p38γ和p38δ缺失均削弱了對TLR4和LPS的先天免疫應答。在來自p38γ/δ缺陷小鼠的LPS刺激的巨噬細胞中，TNF-α、IL-1β和IL-10的產生嚴重降低，而IL-12和IFN-β的產生增加［40］。阻斷p38可下調內皮或上皮細胞的凋亡，對肺泡-毛細血管屏障通透性產生保護作用，阻斷p38 MAPK信號通路可能通過抑制炎癥性巨噬細胞凋亡引起的細胞死亡來抑制過度的肺部炎癥［36］。

4.4 中性粒細胞胞外誘捕網NETs中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）存在于ARDS中，并與ARDS的嚴重程度和死亡率相關［41］。中性粒細胞通常與具有復雜血栓炎癥活動的血小板相關，觸發NETs形成，促使個體發生ARDS。有研究發現，血小板活化可誘導NETs形成，防止血小板活化或干擾NETs成分可保護肺部［2］。NETs是與中性粒細胞衍生的抗菌蛋白復合的絲狀染色質纖維，是病原體封閉和清除的先天機制，但NETs過剩可導致炎癥和損傷［10，42］。NETs結構由與組蛋白相關的DNA組成，也有粒狀蛋白，如彈性蛋白酶和髓過氧化物酶，以及一些細胞質蛋白［43-44］。NETs可能導致肺泡-毛細血管受損，肺內皮受到炎癥介質的攻擊從其正常的抗血栓形成和抗炎表型轉變為促血栓形成和促粘連［45-46］。研究發現，在流感病毒誘導小鼠中，嗜中性粒細胞過度募集、活化和毒性酶釋放可加劇病毒感染對肺泡上皮的損害，導致血管滲漏，肺水腫和低氧血癥，并最終發展為ARDS［45］。中性粒細胞浸潤釋放大量NETs，因其具有細胞毒性或充當內源DAMPs來促進先天免疫和系統性炎癥。此外，NETs可能反過來將更多的炎癥細胞吸引到受損部位，研究發現NETs在急性期通過促進巨噬細胞極化到M1表型而促進ARDS炎癥［42］，并通過增加細胞因子產生來放大炎癥，從而促進ALI/ARDS［44］。

4.5 Nrf2信號通路和自噬在ALI/ARDS中，急性炎癥發生時，肺中多種細胞包括內皮細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，肺泡巨噬細胞和肺泡上皮細胞，可能產生活性氧（ROS），也可能是高氧血癥導致的線粒體或酶系統功能異常而產生ROS［47-48］。近年來，包括氧化磷脂（oxidized phospholipids，OxPLs）在內的氧化基團被認為是PAMPs，被一些保守的PRRs檢測到，并發現酸的吸入可觸發肺氧化應激機制和OxPLs的產生，觸發巨噬細胞產生細胞因子，并通過TLR4激活Nrf2通路并誘導自噬，引起ALI［21，49］。研究表明，Nrf2可能是人類ARDS易感性的候選基因［50］。Nrf2作為基本亮氨酸拉鏈保護轉錄因子，在調節氧化應激反應和抗氧化基因方面起著關鍵作用［51］。氧化應激是由于抗氧化系統失調而導致細胞抗氧化能力和ROS形成失衡的狀態［51］。眾所周知，氧化應激介導的Nrf2磷酸化、Keap1的氧化修飾和共價修飾以及蛋白酶體抑制與Nrf2的大量激活有關［52］。在ALI/ARDS中，ROS修飾Keap1，使Nrf2無法泛素化，并進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，并參與ARE相關基因表達及轉錄［47，51］。Nrf2也可以在ALI/ARDS期間通過自噬來調節。銜接子p62是一種自體吞噬接頭蛋白，p62與Keap1結合，將其隔離到自噬體中并允許Nrf2積累，達到Nrf2通過調節自噬來保護肺損傷的作用［47，49，53］。

4.6 RAGE信號通路晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一種促炎癥模式識別受體PRRs，RAGE在肺遠端與肺泡上皮共定位，其具有放大細胞炎癥反應的功能［54-55］。RAGE是免疫球蛋白超家族的跨膜受體，主要位于Ⅰ型細胞基底表面并被認為是Ⅰ型肺泡細胞損傷的新標志物，RAGE與ARDS嚴重程度及預后相關［56-57］。ARDS期間RAGE表達上調顯著，減少RAGE活化可能是肺損傷的治療靶標［58］。激活的RAGE通過保持穩定的新合成NF-κBp65信使RNA和蛋白質導致核轉錄因子NF-κB持續響應。RAGE信號的主要副產物是形成ROS，其不同配體又可同時激活NF-κB和其他促進炎癥機制，如增加VCAM-1的表達或細胞凋亡，引起持續炎癥反應可導致

ALI［55-56，59］。

5 總結與展望

目前，SARS-CoV-2病毒正處于全球大流行，其嚴重感染者也可并發ARDS、敗血癥和膿毒癥休克以及多器官衰竭。高致病性CoVs、甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）和埃博拉病毒會引起細胞因子/趨化因子過度和長時間的反應，即細胞因子風暴，ALI是肺泡環境和體循環中細胞因子風暴的常見后果，大多數死于這些病毒的患者都會出現ARDS［3-4］。ARDS是ICU中多因素病因學綜合征，其病理生理學包括細胞凋亡過程，以及中性粒細胞通過IL觸發炎癥過程，導致間質水腫，在某些情況下還包括纖維化再生過程［7］。PRRs作為人體免疫的第一道防線，單個PRRs誘導多效性結果的細胞機制是復雜的，是各種PRRs之間相互作用介導的，目前我們還遠遠不能預測整個免疫反應［13］。降低特定PRRs的活性，但仍允許其他PRRs對感染作出反應，可采取針對特定領域PRRs結構以及針對激酶活性或信號傳導中涉及的一些調節蛋白的策略［60］。由于巨噬細胞可以利用依賴TRIF和MyD88的兩種途徑來誘導細胞因子，可通過TRIF抑制來最小化ALI，同時又不影響依賴MyD88的先天免疫功能［21］。TLR4信號涉及多種炎癥過程，抑制TLR4受體并調節其信號通路可能成為ALI的有效治療策略［61］。

研究顯示OxPLs可通過TLR4-TRIF信號增加A型流感病毒感染小鼠肺巨噬細胞因子/趨化因子的產生來促進ALI，因此，抑制OxPLs的策略可能對抑制hCoVs誘導的炎癥有價值［4］。血管緊張素轉換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）通過抑制LPS-TLR4途徑對LPS誘導小鼠ALI具有保護作用，且ACE2是病毒的進入受體，采取ACE2相關疫苗、抑制物等可能成為有效措施［5，62］。TLR激活物和拮抗物在抗病毒藥物和疫苗佐劑的應用中可能是一種具有治療多種呼吸道感染廣譜潛力的化合物，TLR3和TLR4激活物對SARS CoV感染有保護作用［63］。

本文從PRRs所包括的跨膜受體、胞質受體以及炎癥通路，闡述PRRs在ALI/ARDS發病機制中的作用，未來進展將取決于開發新的可以促進和加強肺修復的療法，以期為重大疾病中發生的ALI/ARDS提供新的治療思路。