香果樹保護生物學研究進展

鄭子洪，鄭偉成，鄭蓉，唐戰勝，陳旭波，駱爭榮

（1.浙江九龍山國家級自然保護區管理中心，浙江 遂昌 323300；2.麗水學院生態學院，浙江 麗水 323000）

香果樹Emmenopterys henryi為茜草科Rubiaceae 香果樹屬Emmenopterys落葉大喬木，是第四紀冰川孑遺植物之一。香果樹是一個區域廣布種，主要分布于陜西、甘肅、安徽、江蘇、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、廣西、廣東、四川、貴州和云南東北部至中部海拔430～ 1 630 m 處的山谷林中[1]。香果樹是香果樹屬中已知的唯一現存種[1]，目前香果樹已經成為了香果樹屬系統演化上的一個盲枝[2]。由于人類過度開發森林和土地資源，香果樹的生境受到了極大的破壞，生境片段化加上自身內在原因如種子萌發率低等，使得其天然更新能力差，種群數量越來越少，正瀕臨滅絕，已被列為國家二級保護植物[3]，因此，急需研究其瀕危原因以便加大保護力度。本文從生物與生態學特征、遺傳多樣性和繁育技術等方面綜述了香果樹的研究現狀，提出了現有研究存在的不足，并對今后的研究方向進行展望，以便后期進一步深入研究和保護香果樹。

1 生物學特性研究

1.1 生長發育節律和物候研究

郭連金等對武夷山香果樹種群的開花物候及其影響因素的研究發現，23 年生香果樹個體開始進入生殖期，其單花花期為5～ 9 d，單株花期為15～ 16 d，始花期隨著樹齡的增加逐漸提前，隨海拔升高逐漸推遲，居群花期持續時間在36～ 61 d[4-6]。香果樹個體平均產86 個花枝、7 388 朵花、95 個果實，每個花序有花18～ 30 朵，始花期越早花果的數量越多[4-5,7]。樹齡和海拔是單花花期的主要影響因素[4]。單花花期隨樹齡的增加，呈冪函數的上升趨勢；海拔越高，單花花期越長。香果樹花和果的敗育率較高，分別達81.45%和58.12%，植株所在生境和花果所在的樹冠位置對花和果的敗育率有顯著影響[7]。另外，光照、氣溫、濕度、坡向、喬木層蓋度等都對香果樹花果數量有一定的影響[4-5,7]。

1.2 營養器官解剖結構研究

葉片解剖結構與香果樹的生活環境相適應[8]。正常光照下，香果樹葉為典型異面葉，擁有中生型葉片的構造，氣孔類型為平列型，僅分布于下表皮，柵欄組織發達，葉肉細胞葉綠體與細胞壁平行分布，呈梭形，類囊體排列均勻，淀粉粒和嗜鋨顆粒較少[8–10]。遮光條件下香果樹葉片的厚度、氣孔密度、氣孔器的長度、寬度及面積顯著減小，葉片上表皮增厚，下表皮變薄，柵欄組織變薄，海綿組織不發達，維管束內單列導管數目和導管直徑均明顯增大[11]；同時，葉肉細胞內的葉綠體數量有所增加，在整個細胞中占比顯著增大，淀粉粒含量增多，類囊體排列緊密，堆疊程度增高[9]。這些結構變化說明香果樹有一定的耐陰能力。

從莖和根的結構看，香果樹莖的初生和次生結構中的皮層、髓以及根的韌皮部中許多薄壁細胞具有明顯的網狀結構；在莖的初生構造中，皮層和髓中的生活薄壁細胞豐富；次生木質部為散孔材，導管為單穿孔，導管端壁略傾斜，木薄壁細胞稀少；在老根中，中央無髓[10]。

1.3 繁殖器官特征及傳粉生物學研究

目前，對香果樹繁殖生物學的研究較少，僅程喜梅[6]對河南新縣聯康山自然保護區的香果樹生殖器官進行了比較全面的研究。該研究發現，香果樹兩性花雌、雄異位，花粉量較大，質量好，花粉異型，可育花粉為圓球形，不育花粉常具不規則圓餅狀；雌蕊功能期比雄蕊晚，雌、雄蕊成熟重疊時間少，柱頭活性受環境溫度、光照和濕度的影響；香果樹的繁育系統為兼性異交型；研究期間監測到來自13 科的17 種昆蟲訪花，香果樹主要傳粉昆蟲有中華蜜蜂Apis c erana、熊蜂Bombus i gnites、黑弄蝶Daimio te thys和金毛長腹土蜂Campsomeris prismatica。由于香果樹種群開花不同步、花期中雨季較長、比較缺少傳粉者和雌蕊柱頭易受干擾等原因，香果樹的結實率非常低。

2 遺傳多樣性和親緣地理研究

對香果樹遺傳多樣性的研究有助于擴大對物種生存的認識，也有助于制定有效的長期保護策略。有學者利用隨機擴增多態性（RAPD）分別對浙江省天臺山和湖北神農架香果樹自然居群的遺傳多樣性進行分析，結果發現兩地的香果樹種群內遺傳多樣性均較低[12,13]。在更廣闊的尺度上，研究人員分別采用RAPD 技術和簡單序列間重復（ISSR）標記技術分析來自浙江、福建、江西和湖北的9 個香果樹居群的遺傳多樣性和遺傳分化，結果都表明香果樹在種水平具有較高的遺傳多樣性，而在居群水平的遺傳多樣性較低，居群間遺傳變異程度高，居群間的基因交流頻率很低[14-15]。這表明香果樹種群的分化和隔離可能是特定進化歷史和人類活動的結果。學者據此推斷居群間基因流低于一般水平可能是香果樹的瀕危原因之一[12]。然而，Niu 等利用簡單序列重復（SSR）標記對來自江西、福建、湖南和山西的6 個香果樹居群的遺傳多樣性分析發現香果樹自然種群具有高度的遺傳多樣性，遺傳變異存在于群體內部，群體間存在頻繁的基因交換，認為不同研究結果的差異可能與取樣數量有關，但這些矛盾的結果本身也說明香果樹的遺傳多樣性有待于進一步深入研究[16]。近年來，新的分子標記不斷被開發，如微衛星標記、相關序列擴增多態性（SRAP）標記在香果樹種群中都有較好的多態性[17-18]。這些高度多態性標記將促進香果樹的進化和群體遺傳學研究。另外，香果樹的葉綠體基因組序列的測定更是為遺傳多樣性研究提供了重要的基礎數據[19]。

在全國范圍內取樣，并利用多個分子標記同時開展遺傳多樣性研究可能是較好的方法。張永華的研究利用3 個葉綠體DNA 片段、核糖體DNA 的內轉錄間隔區序列以及擴增片段長度多態性（AFLPs）分子標記聯合分析香果樹分布區內38 個群體的遺傳多樣性、遺傳結構以及譜系地理結構。該研究進一步確認了張文標等的研究結果，并認為香果樹大致以長江流域為界分為兩大譜系，即南部譜系和北部譜系。該研究分析了塑造香果樹的空間遺傳結構的因素，認為地理因素為主導因素，環境氣候因子為重要因素，與溫度相關的生物氣候因子為近期遺傳分化的重要因素[2,20]。

3 生態學特性研究

3.1 種群結構與更新動態研究

香果樹種群結構與動態是目前國內在香果樹瀕危機制研究的重點領域。學者們通過分析各分布地的香果樹種群徑級結構、年齡結構和靜態生命表等研究香果樹種群的動態。大多數香果樹種群結構屬于衰退型，徑級或年齡結構呈紡錘形甚至倒金字塔形，年齡結構不完整，呈現出中、大樹占比較高，幼苗缺乏的特點[3,8,21–25]。調查發現經過強烈的環境篩選，大部分香果樹幼苗生長高度未達到120 cm 即死亡[26]。因此，從種群長期發展來看，多地的香果樹種群的實生幼苗在林下難以更新，僅在受到中度干擾的不穩定生境中，香果樹種群表現出零星更新的模式[27]。緯度位置、巖石裸露度、郁閉度(或喬灌木蓋度)、大氣溫濕度、群落內優勢種群的生長狀況和人為破壞程度等都是影響香果樹幼苗存活和種群發展趨勢的因素[25-26]。

香果樹在自然條件下有萌蘗和種子繁殖兩種方式[28]。研究發現，根萌苗群體的存活曲線明顯不同于實生苗群體的存活曲線。因此，在研究種群結構和動態時應考慮根萌影響[28]。Ma 等通過野外對比調查發現，無根萌現象的香果樹種群數量呈下降趨勢，而依靠根萌和種子繁殖更新的香果樹種群數量呈上升趨勢[29]。張明月等調查發現，湖南八面山的香果樹種群年齡結構呈金字塔形，為增長型種群[25]，這可能與該地香果樹種群的根萌率較高有關。根萌更新延緩了斑塊種群的滅絕時間[30]。

3.2 種子擴散與萌發研究

香果樹的種子小，可以依靠風力擴散到有林窗形成或滑坡等的不穩定生境快速定居和建植[27]。郭連金等對香果樹種子雨和土壤種子庫的觀測研究表明，香果樹種群種子雨可持續近2 個月，尤其是11 月底至12 月中旬為種子雨高峰期；不同齡級香果樹種子雨持續時間及其高峰期有所不同，種子雨強度存在極顯著差異，但其所產的飽滿種子的萌發率及幼苗存活率差異不顯著；20～ 50 年生齡級香果樹的種子飽滿率、母樹下土壤中的種子密度均顯著低于其他齡級的；種子總密度、蟲蛀種子密度、千粒質量以及飽滿種子密度與母樹所在海拔有關[31-32]。凋落的香果樹種子70%以上集中于枯落物和苔蘚層[32-33]。香果樹土壤種子庫為瞬時種子庫，進入種子庫的大約80%的香果樹種子在其萌發前消失，剩余種子中大部分種子也發生霉爛，飽滿種子密度很低，僅1.94 粒·m-2；野外育苗實驗表明香果樹種子的萌發率僅為16.93%，土壤層的種子發芽率顯著高于苔蘚和凋落物層，成苗后僅有3.86%的幼苗壽命超過5 個月[31,33]。在野外對自然萌發的實生苗的監測也發現，5 月份萌發的實生苗僅有6.18%能存活到當年11 月；不同微生境對香果樹幼苗存活率產生顯著影響，林窗是其最適宜微生境，枯落物及苔蘚層的幼苗死亡率顯著高于土壤表面的[31-33]。由此可見，種子發芽階段是香果樹自然更新的最重要限制階段，土壤種子庫的損耗是其種群自然更新困難的主要原因[32-33]。

香果樹野外實生苗的長成率低受多種因素影響。有研究發現香果樹種子的外種皮對其自身萌發具有較大的阻礙[34]，且香果樹落葉和果皮的浸提液對其種子萌發和幼苗生長具有明顯的化感抑制作用[35]。由于種子萌發的光敏特性和幼苗生長對光照的特殊要求（光照過強和過弱都不利于幼苗生長），林下苔蘚和凋落物層對香果樹種子萌發和幼苗生長具有很大的阻礙作用[32]。

3.3 根萌特性研究

當香果樹的根受到機械損傷或根系裸露時，根部就會出現萌蘗[36]。研究顯示，受損根系的根徑越大，根萌數量越多；樹齡越大，根萌能力越強；根系暴露度越高，根萌數量越多[36]。因此，不同地點的香果樹種群的根萌率常存在顯著差異[30]。但從根本上說，香果樹根萌能力的差異與根中的激素濃度有關。細胞分裂素與生長素的高比率意味著香果樹樹樁具有更強的根萌能力[36]。在自然條件下，香果樹根萌多發生于距母樹樹干2 m 以內及直徑2 cm、長度30 cm 的露根上[37]。

郭連金等的研究顯示，在樹冠下、冠緣、林窗以及林緣空地4 種微生境中，根萌苗的苗高、基徑、葉片數量等指標均優于實生苗的，且隨著年齡的增加，兩者差距增大，根萌苗比實生苗更適宜生存于陰暗環境[28]。他們在武夷山的研究發現根萌的苗高、基徑和冠幅均隨著其與母樹樹干間距離的增加而降低；在直徑為6.5 cm 的露根上的根萌苗高和基徑最大；樹冠內的根萌苗的存活率顯著高于樹冠外的[37]。適度的人為干擾，改善林內光照條件，增加土壤有機質含量和礫石覆蓋率有利于香果樹根萌苗的生長[37]。

3.4 種群空間分布格局研究

香果樹種群空間分布格局是另一個研究熱點。在各地開展的香果樹空間分布格局分析普遍都顯示香果樹種群的空間分布呈現聚集特征，尤其在幼苗、幼樹階段聚集強度較高；隨著齡級上升，香果樹的分布格局逐漸從聚集分布過渡到隨機分布[21,24,26,38-39]。香果樹的空間分布格局和研究的尺度大小有很大關系。在香果樹和毛竹Phyllostachys edulis混交林中，香果樹幼苗在小尺度上聚集，而在較大尺度上呈隨機甚至均勻分布；而成年樹則在小尺度上隨機分布而在較大尺度上呈現聚集分布[40]。另外，香果樹的空間格局與其所在群落的類型有關。有研究顯示純林中的香果樹的聚集度強于闊葉雜木林和混交林中的[39]。

香果樹種群的空間格局研究結果反映了兩個重要生態學過程。首先，香果樹的種子雖然帶翅，但繁殖體擴散可能存在較嚴重的擴散限制，從而導致香果樹種群（尤其是幼苗階段）普遍存在聚集分布格局。充分印證了來自于遺傳多樣性和親緣地理學分析關于香果樹不同群體間遺傳分化較大，居群水平的遺傳多樣性較低，基因流較小，擴散阻力較大的結論[2,12,14]。其次，香果樹種群內個體間有較強的競爭或其他抑制作用。對浙江大盤山的香果樹群落的競爭分析結果表明，香果樹的種內競爭強于種間競爭，且隨著徑級的增大種內競爭逐漸增大[41]。強烈的種內競爭可能是香果樹分布格局逐漸變得均勻的重要原因。今后的研究需要進一步加強對這兩種內在機制的驗證，以加深我們對香果樹空間分布格局的理解和認識。

3.5 群落生態學特征研究

香果樹在我國的分布相對較廣，在次生林和原生林中都有香果樹分布[30,42]。在其自然分布區，香果樹可以形成純林，也可以與其他樹種共生組成混交林[3]。在群落生態學方面，調查發現香果樹所在植物群落的物種多樣性有低[8,22]，也有高[23,30,43]，即使在同一地區，香果樹群落的優勢種、物種多樣性和群落所處的演替階段也會表現出較大的差異[25]。這些研究為我們了解香果樹的群落環境提供了重要信息。

3.6 生理生態學特性研究

3.6.1 種子的發芽生理 研究表明，以400 mg?L-1赤霉素浸種可以提高香果樹種子的呼吸速率，加快種子內部貯藏營養物質的分解[44]。在香果樹種子萌發過程中，可溶性糖含量變化的趨勢是先升后降，淀粉酶、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的表達也存在時間差異性[45–46]。劉國勇等發現，在香果樹種子萌發過程中淀粉酶同工酶的主酶帶顏色一直較深，在萌發中后期出現新的酶帶；在萌發初期有新的超氧化物歧化酶同工酶合成；而進入萌發中期新合成的超氧化物歧化酶減弱或消失[45]。張帆等進一步研究發現，α-淀粉酶、β-淀粉酶的活性在種子萌發前一直呈上升的趨勢，但在發芽發生后，α-淀粉酶的活性迅速大幅度上升，β-淀粉酶的活性反而緩慢下降[46]。

3.6.2 光合生理 多項研究結果都顯示香果樹的凈光合速率日進程呈“雙峰”形，在全光照條件下光合“午休”現象十分明顯[9,11,47]。午間葉肉細胞自身活性下降是光合效率降低的主要原因[11,47]。各個生態因子對凈光合速率都有重要的影響，光抑制發生的原因是強光和高溫[47]。在高光強下，香果樹幼苗的葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率和瞬時羧化效率都降低，電子傳遞速率、光化學猝滅系數和非光化學猝滅系數均處于最低水平，而測定初始熒光和最大熒光卻處于最高水平[48-49]。這說明高光強對香果樹幼苗生長極其不利。去除強光后，香果樹幼苗的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、氣孔限制值、胞間CO2濃度和蒸汽壓虧缺或多或少都會恢復[11,49]。外源脫落酸預處理可以通過減輕葉綠素降解、改善瞬時羧化效率、促進光合系統II 反應中心修復、為光化學反應分配更多能量、維持電子傳遞活性，來減輕強光對香果樹光合作用的不利影響，并促進其恢復[49]。輕度遮光（60%透光率）有利于香果樹幼苗提高光合效率[9,11]。由于受到母樹的遮蔭，在母樹樹冠下或樹冠邊緣的香果樹幼苗光合速率日變化呈單峰形[50]。雖然在低光強下葉綠素和類胡蘿卜素含量增加，從而提高光的捕獲能力，但有效輻射強度保持在自然光強的60%左右有利于香果樹幼苗的生長和發育[9,11,48]。野外研究發現在林窗和母樹冠緣生境中香果樹實生苗的生理表現最好，其葉片蒸騰速率、氣孔導度、水分利用效率和凈光合速率均較高[50]。

3.6.3 逆境生理 在浙江大盤山自然保護區的研究發現，香果樹的葉綠素含量隨著海拔的上升而減小，而超氧化物歧化酶活性隨著海拔的上升而增大，這主要是由于相對較強的光照以及干旱脅迫增強所致[51]。丙二醛（MDA）含量和質膜透性在海拔810～ 900 m 處達到最低水平，而脯氨酸、抗壞血酸含量、過氧化物酶活性和抗壞血酸過氧化物酶活性則在該海拔達到最高[51]。這說明中海拔（810～ 900 m）最適合香果樹的生長。另外，研究發現在遮蔭條件下丙二醛含量變化較為緩和，過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性呈現先升后降的變化，但遮蔭條件下的丙二醛含量始終小于全光照條件下的，可溶性糖含量也呈現類似的變化趨勢[9]。

4 繁育技術研究

4.1 實生苗繁育

生物保護工作者很早就開展了對香果樹的播種育苗研究，已經建立了比較完善的播種育苗技術體系[52]。研究表明香果樹種子存在胚的后熟作用，4～ 5℃低溫濕沙貯藏有助于提高種子的萌發力[53-54]。在浙江磐安，秋播的香果樹種子發芽率和幼苗生長勢均比春播的好[55]。還有研究表明在525 nm 波長燈光照射下的香果樹種子萌發率顯著高于其他處理組及自然光對照組的香果樹種子萌發率[56]。在2 200 lx 左右光強下，剛萌發的香果樹幼苗生長迅速，其根徑和株高一直維持在最高水平[55]。

4.2 扦插育苗

扦插育苗具有諸多優點。從解剖學上看，香果樹的營養器官富含薄壁細胞有利于扦插育苗[10]。對于香果樹扦插育苗技術，國內已有相關論文做了詳細的總結[57]，本文不作贅述。國外有關香果樹扦插繁殖的報道顯示，在7 月底至8 月初采集半木質化的枝條作為插穗，用3 × 10-3g?g-1或5 × 10-3g?g-1K-IBA（3-吲哚丁酸鉀鹽）水溶液浸泡10 s 后進行扦插獲得了較好的生根效果（21%～ 71%的生根率）[58]。其技術關鍵是要讓插條在生根容器中不受干擾，并將其放置在溫室中加熱至1℃，溫室濕度保持在85%左右，直到第二年春天。從國內外的實踐結果來看，香果樹扦插繁殖的苗木成活率仍有待提高[58-59]。

4.3 組織培養

組織培養是研究較多的香果樹繁育技術手段。已有的研究表明，帶芽莖段、葉片、葉柄、根和種胚都可以誘導出愈傷組織，建立高頻再生體系[60-62]。姬飛騰等報道了葉片誘導出愈傷組織后形成體細胞胚胎再形成正常植株的技術[63]。而宿靜等認為葉片誘導出的不定芽是不經過愈傷組織階段直接形成的，可能是由芽原基直接分化而來的[64]。對種胚的組織培養研究表明，低濃度的吲哚丁酸有助于成熟胚的萌發，而激素對香果樹不定芽的誘導作用顯著[61]。另外，無根試管苗技術試驗表明，用20 mg?L-1ABT 生根粉處理香果樹無根苗10 min，無根苗在試管外的扦插成活率可達84%[65]。

5 香果樹保護生物學研究存在的主要問題和展望

5.1 涵蓋的生活史階段不全面

就生活史階段來說，先前的研究主要集中在對香果樹種子和幼苗階段，對香果樹生長發育節律和物候的研究數量遠遠不足。雖然已經有研究開展了對香果樹生殖器官特征以及傳粉生物學的研究[4-7]，但有關香果樹花芽分化、雌雄配子體發育和胚胎發育過程的研究幾乎空白。我們需要從生理學、細胞學和解剖學的角度深入研究野外的香果樹大樹開花比例低、花和果敗育和結實率低的原因[8]。另外，今后的研究也應該通過長期監測更多地關注小樹至大樹階段香果樹生長率、死亡率等參數與環境的關系。

5.2 種間互作研究匱乏

目前，有關香果樹的研究主要針對香果樹個體或種群，針對香果樹群落的研究仍較少。關于香果樹與其他植物的競爭、與動物（尤其是昆蟲）和微生物的互作如何影響香果樹在群落中的生存和繁衍的研究仍十分匱乏。例如，已有研究顯示香果樹種子進入土壤種子庫后會遭受巨大損失[32]。動物和微生物在此過程中起著什么樣的作用？在香果樹種子和幼苗階段，是否存在嚴重的密度制約作用[66]？再比如，調查顯示香果樹所在的群落的優勢種、物種多樣性和群落所處的演替階段會有很大差異，但是我們對于群落中的優勢種如何與香果樹互作、群落物種多樣性對香果樹的生長和繁殖到底有什么影響等關鍵問題仍然知之甚少。

5.3 缺少長期系統的監測研究

現有的研究普遍存在取樣面積較小（尤其是群落和種群研究，大多數樣地的面積只有20 m×20 m）、觀測研究時間短的問題，缺少完整而系統的研究。因為缺少長期的監測研究，很多結論來自于空間替代時間的研究方法，如利用靜態生命表來計算香果樹各生活史階段的補員率（即新到達該階段的個體數量與該階段原總個體數量之比）和死亡率[8,21-24,28]，通過分析不同徑級的香果樹的格局差異推斷造成香果樹空間格局變化的原因[26,38-39]。另外，現有的研究普遍缺少綜合性研究手段，沒有將土壤學、分子遺傳學、生理學、植物化學、群落學、微生物學等技術方法整合起來研究香果樹的瀕危機制。

自20 世紀80 年代以來，在世界各地建成的大型固定樣地已經成為目前國內外森林生物多樣性科學綜合研究的平臺[67]。森林大樣地能將森林植物的空間分布信息和時間動態信息很好地整合起來，結合其他的生態學、遺傳學、生物學、土壤學的研究手段，能夠回答很多以往研究無法回答的科學問題，如物種空間分布格局及其形成機制、森林生物多樣性的動態變化等[68]。如將該技術體系綜合應用于香果樹的監測和瀕危機制的研究必將極大地促進我們對該珍稀瀕危物種的了解和保護。

5.4 展望

綜上所述，前人已經從多個方面對香果樹作了廣泛的研究，推斷其可能的瀕危機制，提出了很多行之有效的遷地和就地保護措施[2-3,6,8,61]。這些措施極大地保護了香果樹種群的生存和繁衍。在今后的研究中，我們需要利用綜合技術手段，長期監測各地（尤其是不在自然保護地范圍內的）的香果樹種群動態，進一步通過多學科交叉深入研究香果樹的瀕危機制，以便更好地保護香果樹。